玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性ssr标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记及其应用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] C4植物具有低光呼吸、高氮素和水分利用效率、高光能利用效率的优点；与C4光合 有关的酶在对生物和非生物逆境（如机械创伤、低温、盐害及紫外辐射）的防御反应中也有 较重要的作用。由于主要粮食作物如水稻与小麦等C3植物不具有这些优势，人们就希望将 c4这些优势特征引入水稻等c3作物中。丙酮酸磷酸双激酶（proK)是(：4植物光合作用的 关键酶，主要功能是催化〇)2原初受体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的再生，其中PEP参与固定 〇)2及碳骨架的形成。在C4种子发育过程中，PPDK参与淀粉合成、淀粉一蛋白平衡等重要生 物学过程（王珍梅等，2012;董洋等，2013)。国内外对该基因的研究报道比较多，已有不少 将玉米PPDK基因成功转入水稻中或克隆不同玉米品种（系）PPDK基因的报道（焦德茂等， 2001 ;王德正等，2002 ;袁莉民等，2006 ;张建福等，2006 ;袁定阳等，2007 ;张边江等，2008 ; 王重等，2010 ;宋涛等，2013 ;龚付全等，2014)。这些转基因水稻的C02补偿点和光呼吸速率 显著降低，表观净光合速率提高，产量也有不同程度的提高。
[0003] 为了加快转PPDK基因水稻的选育进程，利用分子标记进行辅助选择是一种比较 快速、适用的技术。一些文献对玉米PPDK基因开发了分子标记进行基因检测（张建福等， 2006 ;袁定阳等，2007;张边江等，2008;龚付全等，2014)。但这些分子标记的碱基序列要么 位于非编码区，要么跨叠非编码区，不利于基因表达分析（转基因的重要目的之一就是希 望目的基因能正常表达）；而且这些标记在不同玉米品种之间或者不同水稻品种之间存在 着差异，不能快速、简单、高效地区分所有玉米PPDK基因与水稻PPDK基因的差异。截止目 前，还未见一个只针对玉米PPDK基因筛选用的专一分子标记的报道。本专利利用NCBI数 据库中有关所有玉米和水稻PPDK基因编码区的遗传信息，通过序列比对软件DNAStar分析 发现，玉米与水稻之间在PPDK基因上差异众多，基本上没有办法进行引物设计，而且不同 玉米品种（系）之间也具有很多差异位点，几乎没有超过50bp完全比对上的位置，这也为 玉米专用PPDK基因引物提出了很大的挑战。于是，我们试着从另外一个角度去考虑这个问 题，选用经典玉米品种B73的PPDK基因（NC_024464)的序列作为参考序列，首先比较不同 品种（系）玉米的PPDK基因在编码区即18个外显子上的差异，其中第2，11和18这3个 外显子序列比较短（彡90bp)，不利于SSR引物设计；第1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16 和17外显子在不同玉米品种（系）中差异就比较大，也不适合设计用于只针对玉米PPDK基 因的通用引物；而外显子15(以玉米品种B73为例，9445-9573,129bp)在NCBI数据库比对 中偶然发现该序列在已报道的所有玉米品种（系）中的碱基序列完全一致，遂利用Primer 5. 0软件对该129bp的碱基序列进行引物设计，其中第39-128bp之间（前后引物各17bp) 具有比较好的SSR引物特征，再把第39-128bp之间这90bp的碱基序列放入NCBI数据库的 水稻基因组中进行比对，没有任何比对结果，说明利用该引物（命名为PK15)在水稻中没法 扩增出相应的90bp长度的片段（图1和图2)，随后合成该引物，进行PCR扩增，结果表明该 引物只在玉米或转玉米PPDK基因水稻中有90bp的扩增片段出现，而在各种不同水稻品种 中没有扩增条带，这为转任何玉米品种（系）的PPDK基因用于水稻育种分子标记辅助选择 提供了一个简单、统一的标准，有利于加快转玉米PPDK基因在水稻育种上的应用。
[0004] 主要参考文献：
[0005]焦德茂等，作物学报，2001，27(2) : 137-143
[0006] 王德正等，中国农业科学，2002, 35(10) : 1165-1170
[0007] 袁莉民等，中国农业科学，2006,39(5):902-909
[0008] 张建福等，分子植物育种，2006,4(5):655-662
[0009] 张建福等，分子植物育种，2006,4(6) :797-804
[0010] 袁定阳等，杂交水稻，2007,22(2):57-63
[0011] 张边江等，中国农业科学，2008,41(10):3008-3014
[0012] 王重等，新疆农业科学，2010,47(12) :2354-2360
[0013] 王真梅等，植物生理学报，2012,48(10):949-957
[0014] 董洋等，黑龙江大学自然科学学报，2013,30(5):642-652
[0015] 宋涛等，江苏农业科学，2013,41(1) :58-61
[0016] 龚付全等，热带生物学报，2014,5(4):326-333
【发明内容】
[0017] 技术问题
[0018] 本发明的目的是提供玉米PPDK基因专一性SSR标记及其应用，在转玉米PPDK基 因水稻的分子标记辅助选择育种中提高选育效率。
[0019] 技术方案
[0020] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
[0021] 一种玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记，其特征在于该标记PK15的正 反引物序列如下：
[0022] 正向引物 5' -3' ：TGAGAAAGTGTTCGCCA，
[0023] 反向引物Y-3^ :TCATCAGCCACCAGAGC。
[0024] 所述玉米丙酮酸磷酸双激酶基因的专一性SSR标记在水稻育种中的应用，包括以 下步骤：
[0025] 1)提取水稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA;
[0026] 2)使用权利要求1所述标记PK15的正反引物序列，PCR扩增转玉米PPDK基因水 稻、玉米基因组DNA和/或RNA或cDNA;
[0027] 3)电泳检测扩增产物，如果出现90bp的条带，则表示该材料基因组中含有玉米丙 酮酸磷酸双激酶基因；如果在转玉米PPDK基因水稻的后代植株中没有出现90bp的条带，则 表示该材料基因组中不含有玉米丙酮酸磷酸双激酶基因。其中，步骤2)PCR扩增具体操作 为：PCR采用 20yL反应体系：模板DNA或RNA1. 0yL，10XPCRBuffer2. 0yL，Buffer中 含 1. 5mMMg2+，2mM的dNTP2. 0yL，0. 2yM的引物 2. 0yL，Taq酶 1U，加ddH20补至 20yL;
[0028] ?〇?扩增条件为：（1)94°(：预变性5111111;(2)94°(：变性308,49.1°(：退火308,72°(：延 伸30s，扩增35个循环；（3) 72°C延伸lOmin，4°C保温。
[0029] 有益效果
[0030] 本发明的优点是：
[0031] 1)本发明所获得的标记是根据玉米PPDK基因内部编码区碱基序列设计的引物， 为基因自身标记，故不存在遗传交换，不需要作表型鉴定。
[0032] 2)由于PK15标记位于玉米PPDK基因的第15个外显子区域，无论是利用基因组 DNA进行检测，还是利用RNA或cDNA进行表达检测，其结果都是准确可靠的。
[0033] 3)本发明的标记为共分离标记，可鉴别玉米PPDK基因存在与否，实验重复性好， 结果可靠。
[0034] 4)由于该标记两端所在的DNA序列在所有玉米品种（系）基因组中高度保守一 致，该标记具有专一性与通用性，在转任一玉米PPDK基因研究中无需再开发新标记即可利 用该标记进行分子标记辅助选择。
[0035] 5)利用本发明的标记进行辅助选择育种，不仅节约成本，而且能够准确、高效地将 玉米高光效PPDK基因转育到C3植物如水稻中去。
【附图说明】
[0036] 图1为玉米PPDK基因第15外显子碱基序列及标记PK15的前后引物序列位置。
[0037] 图2为标记PK15对22个水稻或玉米品种（系）的基因型检测结果（上图为电 泳3〇1^11结果，下图为电泳7〇111111的结果，电泳条件为2%的琼脂糖，100￥电压）。1为 50bpDNAmarker，1 ~22 分别为：苏玉 29、苏科懦 3 号、Kitaake、Koshihikari(越光）、转 P印c基因Kitaake-1 (PC1)、转PPDK基因Kitaake(PK)、转P印c基因Kitaake-2 (PC2)、转 ME基因Kitaake(PME)、R299、转PEPC+PPDK双基因R299-1 (T299-1)、转PEPC+PPDK双基因 R299-2(T299-2)、9311、蜀恢881、黄华占、广恢128、R6547、中佳早2号、Dular、日本晴、日 光、武运粳8号、宁粳3号。
【具体实施方式】
[0038] 1、供试材料
[0039]
[0040] 2.DNA提取
[0041] 在苗期取水稻叶片，基因组DNA的提取参照Xin等（Xinetal.，BioTechniqu es，2003, 34:820-826)简便方法，具体如下：
[0042] 1)用打孔器打取新鲜水稻或玉米叶片约30mm2,转入96孔PCR扩增板中；
[0043] 2)每管加入50uL新鲜配制的buf ferA溶液（100mMNaOH, 2 %Tween20)放入PCR 扩增仪上在95°C下保温lOmin;
[0044] 3)每管加入 50uL的bufferB溶液（lOOmMTris-HCl，2mMEDTA)，温和混匀；
[0045] 4)取luL上清液加入PCR管或96孔PCR板，可作为10-20uL的PCR反应体系的 DNA模板用。
[0046] 3.RNA提取
[0047] 按照天根生物科技有限公司生产的RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒（离心 柱型）DP432的使用说明书进行。
[0048] 1)匀浆处理：50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450y1RL(使用 前请先检查是否已加入0 _巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀。
[0049] 2)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12,OOOrpm离心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中 的细胞碎片沉淀。
[0050]3)缓慢加入0? 5倍上清体积的无水乙醇（通常为225uL)，混匀（此时可能会出 现