用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
【专利说明】用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法
[0001] 本申请是申请日为2012年11月9日、发明名称为"用于治疗、诊断和监测阿尔茨 海默病的方法"的中国专利申请No. 201280055180. 2的分案申请。 发明领域
[0002] 提供鉴定、诊断和预测阿尔茨海默病（AD)(包括AD的特定亚型）的方法，以及治 疗AD (包括特定的患者亚群）的方法。还提供用于鉴定有效的AD治疗剂并且预测对AD治 疗剂的应答性的方法。
[0003] 背景
[0004] 阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD)是一种与认知和记忆功能进行性丧失 和最终痴呆症（dementia)相关的中枢神经系统神经变性疾病。AD是发达国家中最显著的 和常见的痴呆症病因，占所有痴呆症病例的60%以上。在尸体解剖中在AD患者中观察到两 种病理性特征：在海马、大脑皮质和脑部对认知功能重要的其他区域中的细胞外斑块和细 胞内缠结。斑块主要由淀粉状蛋白0 (AP)的沉积形成，所述淀粉状蛋白0是一种来源于 淀粉状蛋白前体蛋白（APP)的肽。
[0005] AD的频率随成年期的每个十年增加，在85岁以上人群中达到20-40%。由于越来 越多的人将活到八十多岁和九十多岁，预计在接下来的20年内患者数目将增至三倍。在美 国有超过五百万人患有AD，其中每年有800, 000例死亡与AD相关。在2011年，护理AD患 者的费用估计为总共1830亿美元。AD还对家庭成员和护理者产生沉重的感情代价：在美 国约有1490万人护理AD患者。AD患者在诊断后平均生活7至10年，并且平均5年的时间 在家庭或在疗养院的看护下。
[0006] 早发型阿尔茨海默病（Early-onset Alzheimer's disease，E0AD)是一种罕见形 式的阿尔茨海默病，其中个体在65岁之前诊断患有该病。所有阿尔茨海默病患者中不到 10%的患者具有E0AD。大约一半的E0AD病例是家族性的，其中疾病遗传性按照常染色体 显性模式遗传。没有发现明显的遗传性模式的AD病例称为"偶发性的"。迄今为止，已经 在具有家族性 E〇AD的家族中鉴定了三种基因中的突变，包括在21号染色体上的淀粉状蛋 白前体蛋白（APP)，在14号染色体上的早老蛋白l(PSENl)和在1号染色体上的早老蛋白 2(PSEN2)。在APP和早老蛋白基因中的大部分致病性突变与APP的异常加工相关，这导致 淀粉状蛋白斑块中主要成分A 0 42的产生增加。
[0007] 晚发型阿尔茨海默病（Late-onset Alzheimer's disease，LOAD)是最常见形式的 阿尔茨海默病，占约90%的病例并且通常在65岁之后发生。LOAD几乎占85岁以上的所有 个体中的一半，并且典型地是偶发性的。基于成对研究（twin studies)，该疾病的遗传可能 性估计为79%，在男性和女性之间的流行性或遗传可能性没有差异（控制年龄后）（Gatz， 等，Arch. Gen. Psychiatry，63:168-74 (2006))。目前鉴定为与早发型阿尔茨海默病相关的 单基因突变似乎不参与晚发型阿尔茨海默病。
[0008] 尽管还没有发现引起晚发型形式的AD的特定的基因，但是增加人们发生该疾病 的危险的一个遗传风险因素与在19号染色体上发现的载脂蛋白E(AP0E)基因相关。早 期的AD遗传研究证明与19号染色体上含有APOE基因的这一区域的相关性和连锁性 (Schellenberg,等，J. Neurogenet?(神经遗传学杂志），4:97-108 (1987) ;Pericak_Vance， 等，Am. J. Hum. Gen.(美国人类遗传学杂志），48:1034-1050 (1991))。APOE基因具有三 个常见的等位基因，称为e 2、e 3和e 4。与常见的e 3等位基因相比，e 4等位基因 增加AD的危险性，而e2等位基因减少AD的危险性。（Corder,等（1993)Science(科 学），281:921-923 ;Corder 等（1994) Nat. Genet.(自然遗传学）7:180-184)。尽管对于一般 群体到85岁的AD的终生危险（lifetime risk，LTR)为11-14%，但是对于APOE 3/4携带者 LTR升高至 23-35%，并且对于 APOE 4/4携带者升高至 51-68% (Genin 等（2011)Molecular Psychiatry (分子精神病学）16:903-907)。对于APOE 2/4携带者的AD危险性与具有中性 基因型APOE 3/3的受试者的相同，而APOE 2/3携带者具有减少的危险性。尽管40-65%的 AD患者具有至少一个拷贝的APOE- e 4等位基因，但是APOE- e 4不是该疾病的必需的决定 因素，原因在于至少三分之一的AD患者是APOE- e 4阴性的，并且一些APOE- e 4纯合子从 来不发生该疾病。因此，该等位基因本身对于AD诊断是不充分的（Ertekin-Taner(2007) Neurol. Clin. 25:811)〇
[0009] 目前，诊断AD的主要方法包括考虑详细的患者病史、实施记忆和心理学测试并且 排除其他关于记忆丧失的解释，包括暂时性（例如，抑郁或维生素B12缺乏）或永久性（例 如中风）病况。以这种方法，直至死亡后AD才能被最终诊断，在死亡后，尸体解剖揭示在患 者脑中的疾病特有的淀粉状蛋白斑块和神经原纤维缠结。另外，临床诊断步骤仅在患者已 经开始表现出显著的、异常的记忆丧失或个性变化后有帮助。到那时，患者可能已经患有AD 数年了。例如，能够允许医师在疾病进程的早期鉴定AD或鉴定处于发生该疾病的高危险性 中的个体的诊断测试将提供在该疾病进程的早期阶段进行干预的选择。与晚期干预相比， 在疾病进程的早期干预通过延迟疾病发病或进展的确通常导致更好的治疗结果。因此，需 要诊断和辅助AD诊断的其他方法。
[0010] 概述
[0011] 本发明提供诊断和预后受试者中的阿尔茨海默病（AD)的方法，所述方法包括检 测在来自所述受试者的样品中存在或不存在一种或多种遗传变异，其中所述遗传变异的存 在表示所述受试者患有或有危险发生AD，如本文公开的。
[0012] 在一个实施方案中，本发明提供一种筛选在具有至少一种APOE-e4等位基因的 受试者中对AD的发生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括，与年龄在75 岁以上、无AD并且具有至少一种APOE- e 4等位基因的对照受试者相比，鉴定在年龄在65 岁以下、患有AD并且具有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者中以增加或减小的频率存 在的遗传变异，其中，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中增加的频率指示所述遗传 变异与具有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者中的有害作用相关，并且，与对照受试者 相比，在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- e 4等位 基因的受试者中的有益作用相关。在一些实施方案中，所述遗传变异使用全基因组关联扫 描（genome-wide association scan)鉴定。
[0013] 本发明还提供一种筛选在具有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者中对AD的发 生具有有害或有益作用的遗传变异的方法，所述方法包括：(a)确定在多名年龄在65岁以 下、患有AD并且具有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者的一个或多个基因座的基因型； (b)确定在多名年龄在75岁以上、无AD并且具有至少一种APOE- e 4等位基因的对照受试 者的一个或多个基因座的基因型；并且（c)与对照受试者相比，鉴定在患有AD的受试者中 以增加的或减小的频率存在的遗传变异，其中，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中 增加的频率指示所述遗传变异与具有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者中的有害作用 相关，并且，与对照受试者相比，在患有AD的受试者中减小的频率指示所述遗传变异与具 有至少一种APOE- e 4等位基因的受试者中的有益作用相关。
[0014] 在这些筛选方法的一些实施方案中，所述有害作用是增加的发生AD的危险。在一 些实施方案中，所述有害作用是AD在较低年龄发病。在一些实施方案中，所述有益作用是 减少的发生AD的危险。在一些实施方案中，所述有益作用是AD在较晚年龄发病。
[0015] 在一个实施方案中，本发明提供一种用于检测受试者中存在或不存在指示阿尔茨 海默病（AD)的遗传变异的方法，所述方法包括：(a)使来自所述受试者的样品与能够检测 基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和 UNC5C的基因；并且（b)确定存在或不存在所述遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所 述受试者患有或有危险发生AD。
[0016] 在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性（SNP)、等位基 因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所 述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的'C'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一 个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的'T'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID N0:3)中编码位置835的氨基酸的密码 子中用G置换A的SNP。
[0017] 在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实 施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨 基酸序列（SEQ ID NO: 1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在 NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传 变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中的氨基酸置换T835M。
[0018] 在所述方法的一些实施方案中，所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核 酶。在其他实施方案中，所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。在一 些实施方案中，所述试剂是被标记的。
[0019] 在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜 刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0020] 在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤（b)的结果治疗所述患者的AD。在 一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种AP0E- e 4等位基因的存在。在 一个实施方案中，与具有至少一种AP0E- e 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传变异 的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种AP0E- e 4等位基因的存在指 示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0021] 本发明还提供用于检测指示受试者中的阿尔茨海默病（AD)的遗传变异的方法， 所述方法包括确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的 基因的基因或其基因产物中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或 有危险发生AD。
[0022] 在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性（SNP)、等位基 因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所 述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的'C'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一 个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的'T'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID N0:3)中编码位置835的氨基酸的密码 子中用G置换A的SNP。
[0023] 在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实 施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨 基酸序列（SEQ ID NO: 1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在 NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传 变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中的氨基酸置换T835M。
[0024] 在所述方法的不同实施方案中，所述一种或多种遗传变异的存在的检测通过选自 由下述组成的组的方法进行：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引 物延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测 定（molecular beacon assay)、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实 施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
[0025] 在所述方法的其他实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异在蛋白中的存在通 过选自下述的方法进行：电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们 的组合。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前，来自所述样品的 蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
[0026] 在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜 刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0027] 在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤（b)的结果治疗所述受试者的AD。 在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种AP0E- e 4等位基因的存在。 在一个实施方案中，与具有至少一种AP0E- e 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标 记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种AP0E- e 4等位基因的存在 指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0028] 本发明还提供一种用于诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括：（a)使 来自所述受试者的样品与能够检测基因或其基因产物中存在或不存在遗传变异的试剂接 触，所述基因选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因；并且（b)确定存在或不存在所述遗传变 异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0029] 在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性（SNP)、等位基 因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所 述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的'C'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一 个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的'T'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID N0:3)中编码位置835的氨基酸的密码 子中用G置换A的SNP。
[0030] 在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实 施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨 基酸序列（SEQ ID NO: 1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在 NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传 变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中的氨基酸置换T835M。
[0031] 在所述方法的一些实施方案中，所述试剂选自寡核苷酸、DNA探针、RNA探针和核 酶。在其他实施方案中，所述试剂是与包含所述遗传变异的蛋白特异性结合的抗体。在一 些实施方案中，所述试剂是被标记的。
[0032] 在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜 刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0033] 在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤（b)的结果治疗所述受试者的AD。 在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种AP0E- e 4等位基因的存在。 在一个实施方案中，与具有至少一种AP0E- e 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标 记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种AP0E- e 4等位基因的存在 指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0034] 在一些实施方案中，所述方法还包括使所述受试者进行选自由下述组成的组的一 种或多种另外的AD诊断测试：筛查一种或多种另外的遗传标记、实施精神状态检查或使所 述受试者进行成像步骤。
[0035] 在一些实施方案中，所述方法还包括分析所述样品以检测作为AP0E修饰物 (modifier)的至少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记处于选 自下述的基因中：编码IL6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的 基因。在不同的实施方案中，所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨 基酸置换R206W的SNP、在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835W的 SNP或表3中列出的SNP。
[0036] 本发明还提供一种诊断或预测受试者中的AD的方法，所述方法包括：确定来自受 试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4和UNC5C的基因的基因或其基因产物 中的遗传变异，其中所述遗传变异的存在指示所述受试者患有或有危险发生AD。
[0037] 在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性（SNP)、等位基 因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所 述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在rs2228145的'C'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨基酸置换R206W的SNP。在另一 个实施方案中，所述遗传变异是在rsl21918427的'T'等位基因。在一个实施方案中，所述 遗传变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835M的SNP。在另 一个实施方案中，所述遗传变异是在UNC5C(SEQ ID N0:3)中编码位置835的氨基酸的密码 子中用G置换A的SNP。
[0038] 在其他实施方案中，所述至少一种遗传变异是氨基酸置换、插入或缺失。在一些实 施方案中，所述遗传变异是氨基酸置换。在一个实施方案中，所述遗传变异是在IL6R的氨 基酸序列（SEQ ID NO: 1)中的氨基酸置换D358A。在一个实施方案中，所述遗传变异是在 NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中的氨基酸置换R206W。在一个实施方案中，所述遗传 变异是在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中的氨基酸置换T835M。
[0039] 在所述方法的不同实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异的存在通过选自由 下述组成的组的方法进行：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物 延伸、等位基因-特异性扩增、等位基因-特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测 定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在确定所述一种 或多种遗传变异的存在之前扩增来自所述样品的核酸。
[0040] 在所述方法的其他实施方案中，检测所述一种或多种遗传变异在蛋白中的存在通 过选自下述的方法进行：电泳、色谱、质谱、蛋白水解消化、蛋白测序、免疫亲和测定或它们 的组合。在一些实施方案中，在确定所述一种或多种遗传变异的存在之前，来自所述样品的 蛋白用与所述蛋白结合的抗体或肽进行纯化。
[0041 ] 在所述方法的一些实施方案中，所述样品选自脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜 刮除物、组织活检、泪分泌物、精液或汗水中的一种。
[0042] 在一个实施方案中，所述方法还包括基于步骤（b)的结果治疗所述受试者的AD。 在一个实施方案中，所述方法还包括检测所述样品中至少一种AP0E- e 4等位基因的存在。 在一个实施方案中，与具有至少一种AP0E- e 4等位基因但是不存在所述至少一种遗传标 记的受试者相比，所述至少一种遗传变异的存在连同至少一种AP0E- e 4等位基因的存在 指示在较早年龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0043] 在一些实施方案中，所述方法还包括分析所述样品以检测作为AP0E修饰物的至 少一种另外的遗传标记的存在，其中所述至少一种另外的遗传标记处于选自下述的基因 中：编码E6R的基因、编码NTF4的基因、编码UNC5C的基因和表3中列出的基因。在不同 的实施方案中，所述至少一种另外的遗传标记是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)中导 致氨基酸置换D358A的SNP、在NTF4的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)中导致氨基酸置换R206W 的SNP、在UNC5C的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)中导致氨基酸置换T835W的SNP或表3中列 出的SNP。
[0044] 本发明还提供一种鉴定具有增加的在较早的年龄发生AD的危险的受试者的方 法，所述方法包括：(a)确定来自受试者的生物样品中存在或不存在选自编码IL6R、NTF4 和UNC5C的基因的基因或其基因产物中的遗传变异；并且（b)确定存在或不存在至少一种 AP0E- e 4等位基因，其中与不存在所述遗传变异和至少一种AP0E- e 4等位基因的受试者 相比，所述遗传变异和至少一种AP0E- e 4等位基因的存在指示所述受试者具有在较早年 龄有AD诊断结果的增加的危险。
[0045] 在不同的实施方案中，所述至少一种遗传变异是单核苷酸多态性（SNP)、等位基 因、单元型、插入或缺失。在一些实施方案中，所述遗传变异是SNP。在一个实施方案中，所 述遗传变异是在IL6R的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)中导致氨基酸置换D358A的SNP。