与玉米热带锈病(玉米壳锈菌)抗性相关联的基因座的制作方法

与玉米热带锈病(玉米壳锈菌)抗性相关联的基因座的制作方法
【专利说明】与玉米热带锈病（玉米壳锈菌）抗性相关联的基因座
[0001] 本申请是申请日为2010年11月3日的中国专利申请201080060463. 7"与玉米热 带锈病（玉米壳锈菌）抗性相关联的基因座"的分案申请。
[0002] 相关申请的夺叉引用
[0003] 本专利申请要求提交于2009年11月4日的美国临时申请61/257, 977的优先权， 该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
[0004] 本公开涉及用于提高植株对热带锈病抗性的组合物和方法和用于鉴定与受关注 的性状相关联的等位基因变异的方法。
【背景技术】
[0005] 热带锈病是由病原体玉米壳锈菌（Physopella zeae (Mains) Cummins&Ramachar) (与Angiopsora zeae Mains同义）引起的真菌病害，其以前归类为Angiopsora zeae Mains (Donald G. White，编辑，1999. Compendium of corn diseases.第三版.APS Press， ISBN 0-89054-234-1)。热带锈病能够快速发展，在短时间内杀死植株。
[0006] 病害管理策略包括作物轮作、通过耕作破坏以前的玉米残留、以及施用杀真菌剂， 全部这些方法旨在减少真菌种菌。然而，控制热带锈病的最有效并且最优选的方法是种植 抗病杂交种。
[0007] 通过减少真菌种菌控制热带锈病的方法需要农民方面附加的时间和资源，并且此 外可能对环境产生破坏效应。这使得种植抗病杂交种对农民和一般公众来说甚至更有吸引 力。因此，希望提供鉴定并选择具有对热带锈病提高抗性的玉米植株的组合物和方法。

【发明内容】

[0008] 提供了鉴定并选择具有对热带锈病提高抗性的玉米植株的组合物和方法。还提供 了标记辅助选择具有对热带锈病提高抗性的植株的方法。
[0009] 在一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株或种质的方 法，所述方法检测与PHMTR(SEQ ID N0 :155)位点16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID N0 : 167位点337-339处的"GAG"单倍型连锁并关联的第一标记基因座的至少一种等位基因的 存在，并且选择包含连锁并关联PHMTR(SEQ ID N0:155)的位点16处的"T"缺失或参考序列 SEQ ID N0 :167的位点337-339处的"GAG"单倍型的第一标记基因座的至少一种等位基因 的玉米植株或种质。在单一减数分裂图谱上，所述第一标记基因座的至少一个等位基因可 与PHMTR(SEQ ID N0 :155)位点16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID N0 :167位点337-339 处的"GAG"单倍型连锁并关联至多20cM。
[0010] 在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株或种质的 方法，所述方法检测PHMTR(SEQ ID N0:155)的位点16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID NO :167的位点337-339处的"GAG"单倍型；并且选择包含PHMTR(SEQ ID NO :155)的位点 16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID NO : 167的位点337-339处的"GAG"单倍型的玉米植 株或种质。
[0011] 在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法使用标记基因座序列、一部分标记基因座序列、或标记基因座序列的互补序列、或 它们的一部分作为标记探针检测玉米植株基因组中的标记基因座。所述标记探针在严格 条件下杂交到介于下述序列之间并包括它们的连续DNA上：SEQ ID N0 :89或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :89具有95%的同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :96或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID NO :96具有95%的同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因 座包含与对热带锈病的提高抗性相关联的至少一个等位基因。
[0012] 在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法检测与所述玉米植株的种质中提高的抗性相关联的至少一个标记等位基因。标 记基因座可选自任一个以下标记基因座：PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、 C00436-801-U、 PHM187-7-U、 C00423-801-U、 PHM5028-24-U、 PHM13818-15-U、 PHM1572卜39-U、 PHM15721-180-U、 C00441-801-U、 C00441-802-U、 PHM4370-19-U、 PHM731-107-U、 C0007卜01-U、 PHM8249-21-U、 C00428-801-U、 PHM18427-13-U、 PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U 和 PHM4003-13-U ;PHM 标记 PHM15590、PHM13818、 PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731 和 PHM15721 ;Sub2e、Sub9d、Subl9c、Sub23m、 C06621-1-K2和C06621-1-K4 ;以及与这些标记连锁的任何其它标记。标记基因座也存在于 染色体10上的任何以下区间内，其包含并侧接：
[0013] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0014] ii PHM15590 和 PHM15721 ;
[0015] iii. C00441 和 C00428 ;
[0016] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0017] V. C00071 和 PHM731。
[0018] 标记基因座包含与增强的热带锈病抗性相关联的至少一个等位基因。
[0019] 在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法检测与对热带锈病的提高抗性相关联的玉米植株种质中的单倍型。所述单倍型在 一个或多个标记基因座上包含等位基因，其中所述一个或多个标记基因座存在于染色体10 上的任何以下区间内，其包含并侧接：
[0020] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0021] ii PHM15590 和 PHM15721 ;
[0022] i i i ? C00441 和 C00428 ;
[0023] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0024] v. C00071 和 PHM731。
[0025] 所述单倍型可包含PHMTR的位点16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID N0 :167的 位点 337-339 处的 "GAG"。
[0026] 在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法。 在该方法中，获取第一玉米植株，其中所述玉米植株具有标记基因座的至少一个等位基 因，所述标记基因座位于染色体10上的任何以下区间内，其包含并侧接：
[0027] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0028] ii. PHM15590 和 PHM15721 ;
[0029] i i i ? C00441 和 C00428 ;
[0030] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0031] v. C00071 和 PHM731 ;
[0032] 并且所述等位基因与对热带锈病的提高抗性相关联。所述第一玉米植株与第二玉 米植株杂交，并且对所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因的评价。然后选择具有所 述第一玉米植株的等位基因的子代植株作为对热带锈病具有提高抗性的植株。
[0033] 在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法。 在该方法中，获取第一玉米植株，其中所述玉米植株在其基因组中包含PHMTR的位点16处 的"T"缺失或参考序列SEQ ID N0 :167的位点337-339处的"GAG"单倍型。所述第一玉米 植株与第二玉米植株杂交，并且对所得子代植株进行PHMTR的位点16处的"T"缺失或参考 序列SEQ ID N0 :167的位点337-339处的"GAG"单倍型的评价。然后选择具有PHMTR的位 点16处的"T"缺失或参考序列SEQ ID N0 :167的位点337-339处的"GAG"单倍型的子代 植株作为对热带锈病具有提高抗性的植株。
[0034] 此外，通过上述方法鉴定或选择的玉米植株是受关注的，其中所述植株不是 CML339。此外，由上述方法鉴定或选择的玉米植株的子代是受关注的。
[0035] 在另一个实施方案中，提供了鉴定与期望的性状形式相关联的等位基因变异的方 法。在这些方法中，比对开放：延伸代价比大于10的原始序列并通过修剪尾部除去背景噪 音。然后修剪随机的等位基因变异，并使用非加权配对组算数平均法（UPGMA)。重复进行随 机等位基因变异的修剪和应用UPGMA于比对直至鉴定出表型关系图。然后可从表型关系图 中鉴定与受关注的表型相关联的等位基因变异。
[0036] 附图和序列表说明
[0037] 根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描 述和附图以及序列表构成本专利申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以 三字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219(No.2) :345-373(1984)所描述的 IUPAC-IUBMB 标准中所规定，2): 345-373(1984)，所述文献全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号 和格式符合如37 C.F.R. § 1.822所示的规则。
[0038] 图1示出定位BAC的物理图谱排列（获取自Maize Genome Browser，它在因特网 上公开可用），它装配到染色体10区域上，该区域由C0497L12和b0191E02定位并包括它 们。示出了本文所述的PHM标记位点（由PHM15590和PHM15721定位并包括它们的区域）， 它们是位于所述区间内的公开标记位点。
[0039] 图2A和2B分别示出了热带和南方锈病评分的PH468 x PHS6Y F2种群的频率分 布。
[0040] 图3示出了使用PH468 x PHS6Y F2种群获得的混合区间作图结果。在染色体10 的短臂上鉴定显著性峰。在x轴上的标记位点对应于PHB基因图谱。y轴代表L0D评分。
[0041] 图4 (a)易感自交系和使用PHS6Y作为供体亲本的对应抗性转化。（b)用易感型自 交系制得的杂交体。（c)用相同自交系的抗性（"转化的"）型制得的杂交体。这显示热带 锈病基因在杂交水平上具有显性效应。
[0042] 图5示出对热带锈病（左侧）高度易感的杂交体和已经从PHS6Y转化成具有提高 抗性的相同杂交体（右侧）。
[0043] 图6示出用作引物设计参考的公开BAC克隆，其用于对热带锈病抗性的和易感的 基因型玉米品系。关于BAC重叠的内部信息用于进一步将2-2. 5Mb区域的序列顺序缩小至 24个子区域。
[0044] 图7示出通过对热带锈病抗性的和易感的玉米品系的基因分型获得的部分参考 序列（顶部），所述基因分型使用设计用于克隆ID Ct9050c064Gllc的PCR引物（SEQ ID N0:133和134)(表9)。SEQ ID N0:137-142示出获取自抗性品系的扩增子，而SEQ ID NO :143-154示出获取自易感品系的扩增子。用灰色突出显示的区域示出参考序列（称为 PHMTR;SEQ ID N0:155)的21bp区域。在bpl6具有T-缺失的玉米品系（用箭头示出）都 显示对热带锈病的提高抗性并具有序列SEQ ID N0 :156。
[0045] 图8示出使用引物SEQ ID NO :135和SEQ ID NO :136获得的扩增子序列的部分比 对。发现"GAG"单倍型（框内）是全部具有提高热带锈病抗性的品系独有的。
[0046] 本文所附的序列描述和序列表遵循在37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的用于 专利申请公开中的核苷酸和/或氨基酸序列的规定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的 核苷酸序列的单字母编码和氨基酸序列的三字母编码，IUPAC-IUBMB标准描述于Nucleic Acids Res. 13:3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(2) :345-373(1984)，所述文献 以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合如37 C.F.R. § 1. 822所示的规则。
[0047] 表1列出了本文所述与InvaderPlus产品标记相关联的序列以及在所附序列表中 的对应标识符（SEQ ID N0 :)。
[0048] 表 1: InvaderPlus产品标记
[0049]
[0050] 表2列出了本文所述与PHM标记相关联的序列以及在所附序列表中的对应标识符 (SEQ ID N0 :) 〇
[0051] 表2: PHM标iP,序列：扩增子和引物信息
[0052]
[0053] SEQ ID NO :129 是被设计用于克隆 ID Ct9050c497L12e 的 L 引物。
[0054] SEQ ID NO :130 是被设计用于克隆 ID Ct9050c497L12e 的 R 引物。
[0055] SEQ ID NO :131 是被设计用于克隆 ID Ct9050c064Glld 的 L 引物。
[0056] SEQ ID NO :132 是被设计用于克隆 ID Ct9050c064Glld 的 R 引物。
[0057] SEQ ID NO :133 是被设计用于克隆 ID Ct9050c064Gllc 的 L 引物。
[0058] SEQ ID NO :134 是被设计用于克隆 ID Ct9050c064Gllc 的 R 引物。
[0059] SEQ ID NO :135 是被设计用于克隆 ID Ct9050bl91E02m 的 L 引物。
[0060] SEQ ID NO :136 是被设计用于克隆 ID Ct9050bl91E02m 的 R 引物。
[0061] SEQ ID NO : 137 是使用 SEQ ID NO : 133 和 SEQ ID NO : 134 作为引物以及 PHS6Y DNA获得的扩增子序列。
[0062] SEQ ID NO : 138 是使用 SEQ ID NO : 133 和 SEQ ID NO : 134 作为引物以及 PHIJG22 DNA获得的扩增子序列。PHIJG22是抗热带锈病的玉米自交系。
[0063] SEQ ID NO :139 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作为引物以及 PH1FI71 DNA获得的扩增子序列。PH1FT71是抗热带锈病的玉米自交系。
[0064] SEQ ID NO :140 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作为引物以及 PH1G3H1 DNA获得的扩增子序列。PH1G3H1是抗热带锈病的玉米自交系。
[0065] SEQ ID N0 :141 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH1JG01 DNA获得的扩增子序列。PH1JG01是抗热带锈病的玉米自交系。
[0066] SEQ ID N0 :142 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PHS7W DNA获得的扩增子序列。PHS7W是抗热带锈病的玉米自交系。
[0067] SEQ ID N0 :143 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH7W3 DNA获得的扩增子序列。PH7W3是易感热带锈病的玉米自交系。
[0068] SEQ ID NO :144 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作为引物以及 PH9VF DNA获得的扩增子序列。PH9VF是易感热带锈病的玉米自交系。
[0069] SEQ ID NO :145 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作为引物以及 PHBNA DNA获得的扩增子序列。PHBNA是易感热带锈病的玉米自交系。
[0070] SEQ ID N0 :146 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH2JR DNA获得的扩增子序列。PH2JR是易感热带锈病的玉米自交系。
[0071] SEQ ID N0 :147 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH0TJ DNA获得的扩增子序列。PH0TJ是易感热带锈病的玉米自交系。
[0072] SEQ ID N0 :148 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH467 DNA获得的扩增子序列。PH467是易感热带锈病的玉米自交系。
[0073] SEQ ID N0 :149 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH48F DNA获得的扩增子序列。PH48F是易感热带锈病的玉米自交系。
[0074] SEQ ID N0 :150 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH7WC DNA获得的扩增子序列。PH7WC是易感热带锈病的玉米自交系。
[0075] SEQ ID N0 :151 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 62OTNA 获得的扩增子序列。625是易感热带锈病的玉米自交系。
[0076] SEQ ID N0 :152 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PHP3P1 DNA获得的扩增子序列。PHP3P1是易感热带锈病的玉米自交系。
[0077] SEQ ID N0 :153 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PHY7M2 DNA获得的扩增子序列。PHY7M2是易感热带锈病的玉米自交系。
[0078] SEQ ID N0 :154 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作为引物以及 PH147G5 DNA获得的扩增子序列。PH147G5是易感热带锈病的玉米自交系。
[0079]