一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及其专用的引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及其 专用的引物对。
【背景技术】
[0002] 马铃薯是世界第三大、我国第四大粮食作物，因其具有耐寒、耐贫瘠、高产稳产、适 应性广、营养全面等优点，在世界范围内广泛种植，对于保障我国及世界的粮食安全具有重 要意义。块茎形状即薯形是马铃薯的重要农艺性状之一，也是鉴别品种特征的重要依据之 一。不同的消费习惯和加工产品对薯形的要求不同，如东北地区消费者偏好圆薯形品种，而 中原和南方地区消费者偏好长薯形品种；一般炸条要求长薯形品种，而炸片需要圆薯形品 种。因此，选育特定薯形的品种满足不同消费者和加工需求，对于促进马铃薯产业全面发展 具有重要意义。
[0003] 传统育种主要依赖于表型选择。可是环境条件、基因型、基因环境互作等多种因素 会影响表型选择的准确性。培育一个优良品种往往需要七、八年甚至十几年时间。分子标 记辅助选择技术可大大提高选择准确性和育种效率，从而加速马铃薯育种进程。而获得易 于操作且与特定性状紧密连锁的分子标记是进行标记辅助选择的前提。马铃薯栽培品种是 高度杂合的四倍体（2n = 4x = 48)作物，遗传背景狭窄、染色体高度杂合、遗传重组频率高 且存在严重的自交衰退现象，开发分子标记困难。而自然界中绝大多数马铃薯以二倍体形 式存在，相对于四倍体，二倍体染色体数目较少，遗传背景相对简单，易于进行遗传分析和 操作。同时，马铃薯单倍型基因组序列框架图已经完成，覆盖了马铃薯95%以上的基因，为 马铃薯分子标记的开发提供了资源。基于上述马铃薯遗传特性，研究者大多利用二倍体材 料开发标记，再将开发的标记应用到四倍体材料中。但是，在将二倍体中开发的标记应用到 四倍体材料过程中也会出现一些问题，由于四倍体马铃薯在减数分裂过程中，有四条同源 染色体发生配对，而且高度异质的远缘杂种常导致在一个遗传位点存在多种等位基因组合 形式，致使染色体发生交换重组而出现标记与性状偏分离、筛选准确率低等问题。因此，二 倍体材料中开发的标记应用到四倍体材料中并不十分顺利。
[0004] 到目前为止，已有几十个马铃薯性状被标记，如包括抗晚疫病、抗青枯病、抗病毒 病等的抗性性状，包括炸片颜色、块茎休眠、薯肉颜色等的品质性状以及耐旱性、耐冻性等 的抗逆性状。但目前可用于马铃薯薯形育种的标记很少，可用于四倍体马铃薯薯形育种的 标记更少，且目前所开发的薯形标记在应用于薯形筛选时，准确性和稳定性较差，筛选效率 低，实际应用效果差。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的方法。
[0006] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的方法包括如下步骤：检测待测马 铃薯的同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸是否为C、第896位脱氧核糖核 苷酸是否为T和第1146位脱氧核糖核苷酸是否为A :
[0007] 1)若待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷 酸为C，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第896位脱氧核糖核苷 酸为T，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第1146位脱氧核糖核苷 酸为A，则待测马铃薯为或候选为圆薯形马铃薯；
[0008] 2)若待测马铃薯的同源染色体上的目标基因不满足上述条件，则待测马铃薯为或 候选为长薯形马铃薯；
[0009] 所述目标基因的序列如序列表中序列3所示。
[0010] 上述方法中，所述检测待测马铃薯的同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核 糖核苷酸是否为C、第896位脱氧核糖核苷酸是否为T和第1146位脱氧核糖核苷酸是否为 A的方法为直接测序。
[0011] 本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的引物对。
[0012] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的引物对由序列表中序列1所示 的DNA分子和序列表中序列2所不的DNA分子组成。
[0013] 本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的PCR试剂。
[0014] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的的PCR试剂包括上述引物对。
[0015] 本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的试剂盒。
[0016] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的试剂盒包括上述引物对或上述 PCR试剂。
[0017] 本发明的第五个目的是提供上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
[0018] 本发明提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测 马铃薯为圆薯形马铃薯还是长薯形马铃薯中的应用。
[0019] 本发明还提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在选育或辅助选育圆 薯形马铃薯和/或长薯形马铃薯中的应用。
[0020] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为圆薯形马铃薯 还是长薯形马铃薯的方法。
[0021] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为圆薯形马铃薯还是长薯形马铃薯的 方法包括如下步骤：
[0022] (1)用上述引物对对待测马铃薯进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0023] (2)用Afl II内切酶对所述PCR扩增产物进行酶切，得到酶切产物；
[0024] (3)检测所述酶切产物的大小；
[0025] 若酶切产物含有大小为700bp和200bp的片段；则待测马铃薯为或候选为圆薯形 马铃薯；
[0026] 若酶切产物仅含有大小为900bp的片段；则待测马铃薯为或候选为长薯形马铃 薯。
[0027] 上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测马铃薯的基因组DNA ;所述PCR扩增的退 火温度为60 °C。
[0028] 上述方法或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述圆薯形 马铃薯为块茎的最大纵轴的长度与最大横轴的长度的比值I < 1. 4的马铃薯；所述长薯形 马铃薯为块茎的最大纵轴的长度与最大横轴的长度的比值I多1. 4的马铃薯；
[0029] 所述纵轴为匍匐茎生长方向；
[0030] 所述横轴为垂直于匍匐茎生长方向。
[0031] 本发明的优点：
[0032] 1)弥补目前马铃薯薯形标记不足及表观选择准确性差、筛选效率低、工作量大的 问题。
[0033] 2)利用本发明开发的标记，在苗期就可以根据马铃薯的DNA进行鉴定，从而确定 其薯形，可节省人力物力，缩短育种周期。
[0034] 本发明以马铃薯二倍体材料，基于马铃薯基因组相关序列信息，结合分离群体分 组分析法（BSA)提供了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法并开发了一个可用于马铃 薯薯形辅助选择的分子标记1137-CAPSVI，可对马铃薯块茎形状进行准确、方便、快速的筛 选。通过实验证明：利用分子标记1137-CAPSVI对四倍体薯形材料进行检测，检测结果与表 型鉴定结果的吻合度达80%以上，其中对圆薯形的吻合度达90 %以上，选择准确率高，稳 定性好，而且在苗期就能对后代进行选择，不受植物生长阶段及环境条件影响，可有效加速 马铃薯薯形育种进程，降低育种成本。
【附图说明】
[0035] 图1为部分试验材料的基因组DNA的电泳检测。
[0036] 图2为PCR产物经Aflll酶切后的电泳图。其中，M:Marker ;P1 :320-02 ;P2 : 10618-01 ;RB :圆形混池；LB :长形混池。
[0037] 图3为四倍体材料薯形鉴定结果频率分布图。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 下述实施例中的长薯形亲本材料10618-01和圆薯形亲本材料320-02均在文献 "Zhang Yong-fei，Genetic analysis of pigmented tuber FLesh in potato, 2009'，中公 开过，公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。
[0041] 下述实施例中的LB固体培养基的配方（1L):胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、 琼脂15g，加入蒸馏