一种利用高速逆流色谱法从马蔺子中分离制备低聚芪类化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用高速逆流色谱法从马蔺子中分离制备低聚芪类化合物的方 法。
【背景技术】
[0002] 马蔺（Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch. )Koidz.)，亦称马莲、马兰、蓝紫 草、兰花草等，是鸾尾科（Iridaceae)鸾尾属（Iris L )多年生草本宿根植物。马蔺自然分 布于我国东北、华北、西北等地，以草原区分布较为普遍。马蔺子味甘，性平，凉血止血，清热 利湿。近代民间有用作口服避孕药和治疗功能性子宫出血、黄疸型肝炎及宫颈癌等疾病。目 前，从鸢尾属中分离得到了多种化合物，主要包括黄酮类化合物及其糖苷、异黄酮类化合物 及其糖苷、苯醌类化合物、三萜类化合物及其皂苷、芪类化合物。
[0003] 低聚芪类化合物具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、神 经保护等作用。为有效开发利用马蔺子资源，以及进一步研究低聚芪类化合物的药理活性 及作用机制，开发从马蔺子中快速制备高纯度低聚芪类化合物的方法具有重要的意义。而 对低聚芪类化合物的分离多采用传统柱色谱分离，由于传统柱色谱具有分离周期长、消耗 大量有机溶剂、对样品的死吸附严重等不足。因此，有必要探索一些高效的方法来制备高纯 度的低聚芪类化合物。
[0004] 高速逆流色谱（High-speed counter-current chromatography，简称HSCCC)分离 技术是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用 两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相 作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依 据其在两相中分配系数的不同而实现，特别适合于天然产物活性成分的分离。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用HSCCC技术从马蔺子中提取分离四种低聚芪类 化合物的方法。
[0006] 具体地，本发明提供了一种利用高速逆流色谱法从马蔺子中分离制备低聚芪类化 合物的方法，它包括如下操作步骤：
[0007] (1)粗提物的制备：
[0008] 将马蔺子粉碎后，用50-90% v/v乙醇提取，提取液减压浓缩回收溶剂后得到乙醇 粗提物，即待分离样品；
[0009] (2)采用高速逆流色谱法分离vitisin A、流分II和e _viniferin( e-葡萄素）：
[0010] 取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2~6 : 4~7 : 2~6 : 3~7,置于 分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；将固定相充满逆流色谱的 色谱柱，在25~35°C下，主机正转，转速为800~900r/min，然后以1. 5~lOml/min的流 速栗入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；步骤（1)制备的粗提物，以流动相为溶剂 溶解，制备样品溶液；将样品溶液进样，在紫外检测器下分别接收各目标成分，浓缩、干燥， 即可分别得到vitisin A、流分II和e -viniferin ;
[0011] (3)采用高速逆流色谱法分离vitisin B和vitisin C :
[0012] 取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2~7 : 2~7 : 2~7 : 2~7,置 于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相充满逆流色谱 的色谱柱，在25-35°C下，主机正转，转速为800~900r/min，然后以1. 5~lOml/min的流 速栗入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；取流分II，以流动相为溶剂溶解，制备样 品溶液；将样品溶液进样，在紫外检测器下分别接收各目标成分，浓缩、干燥，即可分别得到 vitisin B 和 vitisin C ；
[0013] 其中，步骤（2)、（3)中的紫外检测波长为325nm。
[0014] 进一步地，步骤（1)中，乙醇浓度为75~90% v/v，优选为80~90% v/v，更优选 为 85% v/v。
[0015] 进一步地，步骤（1)中，乙醇提取次数为1~5次，优选为3次。
[0016] 进一步地，步骤（2)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2.5~3 : 6~ 6. 5 : 4 ~4. 5 : 5 ~5. 5。
[0017] 进一步地，步骤（2)中，vitisin A、流分II和e-viniferin的出峰时间依次为 40 ~130min、75 ~175min、90 ~205min。
[0018] 本发明一个【具体实施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 3 : 6.5 : 4.2 : 5. 5, vitisin A、流分II和e-viniferin各成分的出峰时间依次为60~ 80min、115 ~135min、140 ~155min〇
[0019] 本发明另一个【具体实施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 2. 5 : 6 : 4.5 : 5，vitisin A、流分II和e-viniferin各成分的出峰时间依次为90~ 130min、145 ~175min、180 ~205min〇
[0020] 本发明另一个【具体实施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 3:6.4:5，￥；11:18；[11厶、流分11和￡-￥；[111€61'；[11各成分的出峰时间依次为40~60111；[11、 75 ~85min、90 ~105min0
[0021] 进一步地，步骤（2)中，在25°C下，主机正转，转速为900r/min，然后以1.5~ 2. 5ml/min的流速栗入流动相。
[0022] 进一步地，步骤（3)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为5 : 5 : 3 : 6~ 1。
[0023] 进一步地，步骤（3)中，vitisin C和vitisin B的出峰时间依次为135~182min、 145 ~200min。
[0024] 本发明一个【具体实施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 5 : 5 : 3 : 6，vitisin C和 vitisin B 的出峰时间依次为 135 ~142min 和 145 ~155min。
[0025] 本发明另一个【具体实施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 5 : 5 : 3 : 7，vitisin C和 vitisin B 的出峰时间依次为 155 ~182min 和 185 ~200min。
[0026] 本发明另一个【具体实施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为 5 : 5 : 3 : 6，vitisin C和 vitisin B 的出峰时间依次为 135 ~142min 和 145 ~155min。
[0027] 进一步地，步骤（3)中，在35°C下，主机正转，转速为800r/min，然后以3.0~ 5. Oml/min的流速栗入流动相。
[0028] 本发明的优点：
[0029] 1、与传统柱色谱分离技术相比，本发明采用高速逆流色谱（HSCCC)分离技术，不 但有效地缩短了分离时间，而且减少了工艺过程中的有机溶剂消耗和能耗。
[0030] 2、本发明通过两次HSCCC分离可以得到4种高纯度（可达到95%以上）低聚芪类 化合物，BP vitisin A、e-viniferin、vitisin B 和 vitisin C。
[0031] 3、本发明制备所得4种低聚芪类化合物分别经UV、ID (1H-NMR和13C-NMR)和 20(?-? COSY，HMBC和HSQC)核磁谱进行结构确认鉴定。
[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所 述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
【附图说明】
[0033] 图1为马蔺子乙醇粗提取物、流分II、vitisin A、e-viniferin、vitisin B及 vitisin C的高效液相色谱图
[0034] 图 2 为 vitisin A、e-viniferin、vitisin B 及 vitisin C 的全波长扫描图
[0035] 图3为本发明应用高速逆流色谱法分离制备vitisin A、e -viniferin和流分II 的分离制备图
[0036] 图4为本发明应用高速逆流色谱法分离制备vitisin B和vitisin C的分离制备 图
[0037] 图5溶剂系统为"正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为4 : 6 : 5 : 5"时，流 分1，流分II和流分2的分离制备图谱
[0038] 图6溶剂系统为"石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为5 : 5 : 3 : 6"时，流 分3和流分4的分离制备图谱
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例所用仪器与试剂均如下所示：
[0040] TBE-300C高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）；同时配有TBP5002恒 流栗（上海同田生物技术有限公司），DC-0506低温恒温槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公 司），UV-2000D检测器（上海同田生物技术有限公司）和EasyChrom-1000 色谱数据工作 站（上海同田生物技术有限公司）。Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司），配有 G1311C四级栗，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱和G131?二极管阵列检测器。
[0041] 下述实施例中均采用HPLC法对各流分进行纯度检测（峰面积归一法），其色谱条 件为：Eclipse XDB (：18柱（250mmX4. 6mm，5 ym);流动相：甲醇-乙腈-水溶液；梯度洗脱 程序具体如下：0-20min，流动相为30-50 %的甲醇，的5 % -5 %乙腈；21-35min，流动相为 50-65%的甲醇，5% -5%乙腈；流速：1.0ml/min ;柱温箱温度为30°C ;检测波长为325nm。
[0042] 实施例1
[0043] 一种利用高速逆流色谱法从马蔺子中分离制备低聚芪类化合物的方法包括以下 步骤：
[0044] (1)将马蔺子粉碎后，用85%乙醇提取3次，过滤，减压浓缩回收溶剂后得到乙醇 粗提物，即待分离样品
[0045] (2)将含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的有机溶剂体系混合均匀后静置分层，分 别取上层溶剂和下层溶剂，超声脱气20min，以上层溶剂作为固定相，下层溶剂作为流动相， 向高速逆流色谱仪的分离管中栗入所述固定相，保持分离管温度25°C，以900rpm的转速正 转20min后，栗入流动相，待体系平