Flammeovirga sp. SJP92 β-琼胶酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及琼胶酶，尤其是涉及Flammeovirga sp. SJP92 P -琼胶酶及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 琼胶由琼脂糖（agarose)和琼脂胶（agaropeetin)组成。琼脂糖是由 1，3-0-0 -D-半乳吡喃糖和1，4-0-3, 6-内醚-a-L-半乳吡喃糖反复交替组成的链状分子； 琼脂胶结构比较复杂，在交联的半乳糖链上含有D-半乳糖、3, 6-半乳糖苷、半乳糖醛酸和 硫酸基、丙酮酸等取代基团。
[0003] 根据琼胶酶水解琼脂糖方式不同，可将其分为a_琼胶酶和P_琼胶酶。a_琼 胶酶裂解琼脂糖的a-1，3糖苷键，生成以P-D-半乳糖为非还原性末端和以3, 6-内 醚-<1-1^-半乳糖为还原性末端的琼寡糖（3831'〇〇118〇83〇〇1^1^(168)系列。而0-琼胶 酶则裂解琼脂糖的(6-1, 4-糖苷键，生成以P-D-半乳糖为还原性末端和以3, 6-内 醚-〇-1^-半乳糖为非还原性末端的的新琼寡糖（11603831'0〇118〇83〇〇1^1^(168)系列。目前 所发现的琼胶酶中，大多数都是(6-琼胶酶，只有少数几种是a-琼胶酶。
[0004] 琼胶酶在科学研究、食品、医疗保健等领域具有广泛的应用价值。在分子生物学 实验中，利用琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA，已经被证明是最好的方法之一。由于 琼胶是某些红藻细胞壁的重要组成成分，因此琼胶酶可以用作海藻酶解的工具酶，来获得 DNA、蛋白质、单细胞或原生质体，用于海藻细胞生理生化的研究，以及用于进行细胞间的融 合和目的基因的导入。通过测定琼胶酶水解某些海藻多糖的水解产物结构可用于推测海藻 多糖的结构。由于酶降解具有专一性、高效性、降解条件和过程易于控制、无副反应等优点， 因此该方法应用较广泛。酶能够降解多糖，得到相对分子质量比较均一的降解物，对多糖的 主体结构不会产生影响，因此还可利用琼胶酶水解藻类获得海藻单细胞作为饲料用于海水 动物的养殖。此外，琼胶酶还可用于琼脂寡糖的制备。琼脂寡糖在食品生产中有广泛的应 用，如作为天然防腐剂、淀粉老化抑制剂、高甜度甜味剂的填充剂及分散剂、功能性食品基 料、抗氧化剂等。在药物应用方面，琼脂等海藻多糖一定分子量的降解产物具有抗肿瘤、抗 病毒和增强免疫等作用。近来在日用化工领域又发现了琼脂寡糖的一些新用途，日本以琼 脂寡糖为添加剂生产的化妆品对皮肤的保湿效果良好，对头发也有很好的调理作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-琼胶酶；
[0006] 本发明的第二目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-琼胶酶基因agaB的核苷酸 序列；
[0007] 本发明的第三目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-琼胶酶蛋白的氨基酸序 列；
[0008] 本发明的第四目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-琼胶酶的制备方法。
[0009] 本发明的第五目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P -琼胶酶AgaB的生物学活 性。
[0010] 所述Flammeovirgasp. SJP920 -琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 10071。
[0011] 所述 Flammeovirgasp. SJP92 0 -琼胶酶基因，其编码 Flammeovirga sp. SJP92P-琼胶酶的核苷酸序列，记作agaB。
[0012] 所述Flammeovirgasp. SJP92P-琼胶酶基因agaB的分子类型为DNA，序列 特征：长度为2547bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述Flammeovirga sp. SJP92 -琼胶酶基因agaB的序列如下所示，记为SEQIDNo. 1 :
[0015] 本发明所述Flammeovirgasp.SJP92P-琼胶酶基因，其核苷酸序列采用以下方法 获得：提取 Flammeovirgasp.SJP92 的总 DNA，以合成序列SEQID No. 3,SEQID No. 4 作为 引物，经PCR扩增获得agaB基因核苷酸序列SEQID No. 1。agaB基因相关的核苷酸序列 SEQID No. 1通过基因预测获得基因编码的多肽SEQID No. 2序列。然后通过原核重组表 达agaB基因，纯化agaB基因的表达产物，并通过生物学方法证明agaB基因编码的多肽SEQ IDNo. 2 (不含信号肽）具有琼胶酶活性。
[0016] 本发明所述Flammeovirgasp.SJP92P-琼胶酶包括具有降解琼脂糖活性的 Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶 AgaB。
[0017] 所述合成序列SEQIDNo. 3：CGGGATCCCAGGATTGGAGCGGTATT〇
[0018] 所述合成序列SEQIDNo. 4：CCGCTCGAGTTAGTTCATTAGTACCACTTT〇
[0019] 所述Flammeovirgasp.SJP92P-琼胶酶AgaB的分子类型为蛋白质，序列特征：长 度为849aa，类型为氨基酸，所述Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶AgaB的序列如下所示， 记为SEQIDNo. 2 :
[0021] 所述Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶，其蛋白具有SEQIDNo. 2所示氨基酸序 列的多肽；或将SEQIDNo. 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有与SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。
[0022] 本发明所述Flammeovirgasp.SJP92P-琼胶酶的制备方法，包括以下步骤：
[0023] I) Flammeovirgasp.SJP92 总DNA的提取；
[0024] 2) Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶 agaB 的PCR扩增和序列分析；
[0025] 3)Flammeovirgasp.SJP92P-琼胶酶的重组表达以及纯化。
[0026] 本发明通过提取Flammeovirgasp.SJP92的总DNA，通过引物扩增，克隆和鉴定了 0 _琼胶酶基因agaB。通过构建重组原核表达载体，在大肠杆菌中进行重组蛋白表达，克服 了原菌分离纯化过程中复杂繁琐、产量低等不足。同时纯化后的蛋白纯度高、活力好，为该 蛋白能广泛应用于生物、食品、医药等研究领域奠定基础。
【附图说明】
[0027] 图1为agaB基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker;1 :重组载 体pET-28sumo_agaB在菌株BL21 (DE3)的未诱导表达；2 :重组载体pET-28sumo_agaB在 菌株BL21(DE3)的诱导表达后超声破碎后上清；3 :重组载体pET-28sum〇-agaB在菌株 BL21(DE3)的诱导表达超声破碎后包涵体。
[0028] 图2为AgaB-sumo纯化的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker;1 :经镍柱介质纯 化所得的目的蛋白AgaB-sumo。
[0029] 图3为AgaB酶活染色图谱。M:蛋白Marker;1 :AgaB对应的SDS-PAGE图；2:AgaB 酶活染色.（此结果中的目的蛋白已切除sumotag，其分子量为15kDa)。
[0030] 图4为TLC检测重组-琼胶酶AgaB的降解产物。1 :重组-琼胶酶AgaB的降 解产物；2 :新琼八糖；3 :新琼四、六糖。
[0031] 图5为温度对重组P-琼胶酶AgaB的影响图谱以及该酶的温度稳定性。横坐标 表示不同温度；纵坐标表示琼胶酶的相对活性。
[0032] 图6为pH对重组-琼胶酶AgaB的影响图谱以及该酶的PH稳定性。横坐标表 示不同pH;纵坐标表示琼胶酶的相对活性。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔（著），黄培堂（译），《分子克隆实验指 南》，科学出版社，2002年，第三版）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议 的条件。
[0034] 为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
[0035] I.Flammeovirgasp.SJP92总DNA的提取（本实验采用上海赛百盛公司试剂盒提 取基因组，具体步骤和试剂请参照该公司试剂盒说明书）：
[0036] 取2mL离心管，倒入预先培养的菌液，13000rpm离心2min后弃上清；将菌体悬浮 于IOOyLTE缓冲液中，加入ImLXN结合液，轻柔颠倒混匀；将混合液小心转入离心柱中， 静置3~5min，然后13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；在离心柱中加入0. 5mL漂 洗液（加入漂洗液后静置2~3min)，13000rpm离心30s，共漂洗4次；再用0. 5mL70%乙 醇漂洗1~2次，静置2~3min后13000rpm离心30s;将离心纯化柱再次离心Imin;将离 心纯化柱套入一个新的干净的I. 5mL离心管中，开盖放置2~3min使乙醇挥发；之后加入 20yLddH20于硅胶膜上；静置2~5min后，13000rpm离心lmin。收集的液体即为所提取 的基因组。
[0037] 2.Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶基因的PCR扩增和序列分析
[0038] 以Flammeovirgasp.SJP92总DNA为模板，用引物F和R扩增P-琼胶酶agaB基 因（不含信号肽）。
[0039] F：CGGGATCCCAGGATTGGAGCGGTATT(SEQIDNo. 3)；
[0040] R：CCGCTCGAGTTAGTTCATTAGTACCACTTT(SEQ ID No. 4)；
[0041] 划线部分GGATCC代表BamH