一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记领域，具体地说，涉及一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其 应用。
【背景技术】
[0002] 近二十年来，肉鸡遗传改良在体增重、生长速度及饲料报酬等方面取得了较大的 进展，但同时也伴随着脂肪的过度沉积，特别是腹脂沉积。现代商业肉鸡品种每公斤体重就 包含150-200g的脂肪，这些脂肪中约80%并非生理需求，从而大大降低了饲料利用率。这 些多余的脂肪在屠宰时只能当废弃物丢弃，不但会直接影响肉产品的加工，而且还造成了 一定的资源浪费和环境污染。脂肪的过度沉积已成为肉鸡生产中所面临的一个严峻问题。 因此，低腹脂沉积一直是肉鸡品系选育的重要目标之一。
[0003] miRNA(MicroRNAs)是一类非编码单链RNA分子，在细胞增殖、分化和凋亡、肿瘤形 成等生理过程中发挥重要的调控作用。近年来的研究表明，miRNA是人类和动物脂肪细胞 分化、脂肪沉积过程中所不可缺少的调节因子。如果可以获得与主选性状及其关键基因相 关的miRNA作为分子标记，即可以实现目标性状的早期选择，加快遗传选择进展。
[0004] miRNA对动物生长发育的调控作用是通过调控其特定靶基因来实现，仅仅借助 于生物信息软件来预测靶基因，无疑将会是大海捞针。而通过某一特定时期、特定组织中 miRNA和mRNA同时深度测序分析，根据miRNA和mRNA呈负相关表达的原理，并结合靶基因 软件预测的结果，会大大缩小对目标miRNA革E基因的筛选范围。通过miRNA-mRNA联合分析， 为鉴定调控腹脂沉积这类复杂性状的miRNA提供了一个全新手段。
[0005] 综上所述，在当前家禽饲养成本急剧飙升的情势下，利用分子标记辅助选择法对 腹脂沉积这一复杂性状进行选择提高，可较大的提高饲料报酬，进而节省新品系选育的成 本。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与鸡腹脂沉积相关的 miRNA及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA，所述 miRNA的靶标基因是ACSLl。
[0008] 进一步地，所述miRNA为gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 本发明进一步提供了前述miRNA在调控前脂肪细胞增殖和分化中的应用，所述 miRNA通过调控ACSLl基因的表达，调控前脂肪细胞的增殖和分化。
[0010] 本发明还提供了前述miRNA作为分子标记在遗传标记辅助育种和改善鸡腹脂沉 积中的应用。
[0011] 进一步地，所述应用具体为通过检测鸡腹脂组织中所述miRNA的表达水平，判断 鸡腹脂重/率的高低从而进行筛选。
[0012] 本发明还提供了检测前述miRNA表达水平的方法，所述方法包括如下步骤：
[0013] (1)提取待测鸡腹脂组织中含有小RNA的总RNA;
[0014] (2)通过poly(A)聚合酶在miRNA的3'末端加上多聚A，以互补的多聚T为3'引 物，利用反转录酶进行miRNA反转录；
[0015] (3)采用miRNA特异正向引物TGTGCAAATCCATGCAAAAC
[0016] TGA及适用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行gga-miR-19b-3p的扩增；扩增后 利用2AAe法计算获得gga-miR-19b_3p表达水平。
[0017] 本发明还提供了一种检测鸡腹脂组织中gga-miR-19b_3p表达水平的荧光定量 PCR试剂盒。
[0018] 所述试剂盒包括：反转录试剂、目的miRNA的特异性上游引物、内参引物和荧光定 量PCR反应液。
[0019] 所述目的miRNA的特异性上游引物序列为TGTGCAAATCCATGCAAAACT
[0020] GA0
[0021] 内参上游引物可以为：CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCCCTGTCTC。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明提供的miRNA(gga-miR-19b-3p)与鸡腹脂沉积具有很好的相关性，通过有 效性和分子生物学验证，gga-miR-19b-3p在高低腹脂组样本间差异表达10倍以上。本发 明提供的miRNA可用于鸡腹脂重/率相关的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择。
[0024] 本发明提供的检测gga-miR-19b_3p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA 提取到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便使用、简化操作，又保证了结果的一致性。
【附图说明】
[0025]图 1 为ACSLl的 3'UTR与gga-miR19b-3p的结合位点。
[0026] 图2为gga-miR-19b-3p在高低腹脂表型组中相对表达量结果，**p〈0. 01。
[0027] 图3为ACSLl在高低腹脂表型组中相对表达量结果，**p〈0. 01。
[0028] 图4为gga-miR-19b-3p的靶基因双荧光素酶验证，#p〈0. 01。
[0029] 图5为转染gga-miR-19b_3p模拟物后gga-miR-19b_3p的表达变化。
[0030] 图6为过表达gga-miR-19b_3p前脂肪细胞增殖的变化。
[0031] 图7为过表达gga-miR-19b-3p后脂滴沉积变化。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 实施例1基于高通量测序技术的miRNA和mRNA联合分析获得腹脂沉积关键基因 (ACSLl)及其调控miRNA (gga-miR-19b-3p)
[0034] 1)实验动物和样本准备
[0035] 以北京油鸡和科宝肉鸡杂交产生的F2代183只母鸡（中国农业科学院北京畜牧 兽医研究所昌平试验基地）为试验素材来源。饲养至93天，进行屠宰、称取全净膛重和腹 脂重，计算腹脂率（腹脂重/全净膛重）。采集腹脂组织样本迅速放入液氮中冻存。
[0036] 根据腹脂重和腹脂率的表型数据，将腹脂重彡66. 64g、腹脂率彡5. 15%归为高表 型组，而腹脂重< 34. 50g、腹脂率<I. 84%归结为低表型组。从183只母鸡中选取6对具 有极端表型值（极高和极低）的全同胞母鸡；将选出的高、低表型组样本，商业用试剂盒提 取腹脂组织中总RNA，组建两个RNA等量混合池；分别构建用于miRNA和mRNA测序的cDNA 文库。送测序公司进行测序。
[0037] 2)基于高通量测序结果分析差异表达miRNA和mRNA
[0038]将RPM^5、p〈0.0 5 (Fisher，s exact test和Chis quare检验）且高低表型组间 差异倍数彡1. 5的miRNA定义为差异表达miRNA ;miR-19b-3p在高、低表型组中，差异倍数 达为5倍以上；差异表达mRNA的定义为：必须符合两组中有一组的FPKM彡10、p〈0. 05且 差异倍数彡2或<0. 5。
[0039] 3)差异表达miRNA和mRNA联合分析进行关键miRNA筛选
[0040] 利用miRanda和Targetscan算法，基于鸡的Ensemble数据库，对所有差异表达 miRNA和差异表达mRNA进行联合分析，即对差异表达miRNA进行靶基因预测。再将预测得 到的革G基因与mRNA转录组测序中所鉴定的差异表达mRNA进行交集分析，交集部分定义为 "交集基因"。通过进一步分析发现，交集基因ACSLl在多条脂代谢信号通路中发挥作用，同 时参与不饱和脂肪酸的生物合成途径、代谢通路、过氧化物酶体和脂肪酸代谢途径。
[0041] 靶基因预测结果表明，ACSLl的3'UTR区与gga-miR19b-3p种子序列有7个碱基 互补结合（图1)。ACSLl基因为下调基因，gga-miR19b-3p为上调基因，符合miRNA负调 控的功能预期，即大多数miRNA对靶基因表达具有负调控作用，因此推测差异表达miRNA， miR-19b-3p，参与调控ACSLl的表达。
[0042] 实施例2利用不同群体对gga-miR-19b-3p标记与腹脂重/率的相关性进行验证
[0043] 用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对miRNA和mRNA高通量测序中鉴定获得的关键 gga-miR-19b-3p及ACSLl的表达进行扩大样本验证。
[0044] 1)实验样本准备
[0045] 200只北京油鸡（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所母鸡饲养至93日龄，进行 屠宰、称取全净膛重和腹脂重，计算腹脂率（腹脂重/全净膛重）。采集腹脂组织样本迅速 放入液氮中冻存。根据腹脂重和腹脂率的表型数据，基于高低组间腹脂重/率相差五倍以 上的标准，共选择出12个（高、低表型组各6个）具有极端表型值的个体。
[0046] 2)gga-miR-19b_3p差异表达验证
[0047] 提取腹脂总RNA:北京天根公司总RNA提取试剂盒法ACSLImRNA定量的条件 为：试剂盒miScriptIIRTKit(Qiagen,德国）进行反转录；试剂盒QuantifastSYBR GreenPCRKit(Qiagen,德国）进行qRT-PCR。引物为（F:CAAAGGAGAAGGTGAGGTGTG; R:CTTCAACGTACCGTTTGGTAG)。引物的终浓度为lOumol。检测每次设