一种适用于高通量测序的破碎dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因高通量测序及DNA片段制备技术领域，具体地，涉及一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法。
【背景技术】
[0002]在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对数据分析有着莫大的关联。在测序文库构建的开始，先要对DNA样品进行片段化。目前，DNA片段化的方法有多种，如酶切法、只适应聚焦超声波(AFA，Adaptive Focused Acoustics)断裂法等。酶切法根据酶的选择，又可以分为两类，一类是使用特定酶切位点的限制性内切酶进行DNA片段化，另一类是通过酶组合对DNA进行随机断裂。酶切法不仅对样品纯度要求较高，而且对随机性有所限制。只适应聚焦超声波断裂法(AFA)是较为理想的DNA片段化的方法，尤其是Covaris公司出品的超声波断裂DNA的仪器，具有片段化精准，成功率高等特点。但是，Covaris相关产品价格相当高，一个样品的费用为40-60元人民币，包括仪器和耗材，且操作较为繁琐，等待时间较长。因此需要一种新的易于操作的破碎DNA的方法，既能够精准、高效率、高通量破碎片段、又能够大大降低耗材、仪器成本。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、破碎DNA效果良好、适用于高通量测序的破碎DNA的方法。
[0004]本发明提供的一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法，包括以下步骤:
[0005](I)将待破碎样品的DNA或DNA的双蒸水溶液加入PCR板的PCR孔中，加入的总体积不超过30 μ I，盖上配套盖子；
[0006](2)使用超声波清洗仪清洗步骤⑴得到的PCR板破碎其中的样品DNA。
[0007]本发明方法中，步骤(I)所述的PCR板为适用于标准PCR仪的PCR板，可根据实际需要选择PCR孔的数目。
[0008]进一步地，当所使用的超声波清洗仪的换能器功率为50瓦，且该清洗仪仅有I个换能器时，PCR板的PCR孔数不多于24个。
[0009]本发明的实施例中，所使用的超声波清洗仪由江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E或KQ5200E，具有I个换能器，换能器的功率为50瓦。PCR板为Asygen公司PCR-96-C，PCR板中每个PCR孔的容积为200 μ I。使用时，从96孔PCR板上剪取4 (横或纵)X 5 (纵或横)=20个孔。
[0010]本发明方法中，步骤(I)中样品DNA的总量为10ng <和> 20 μ g，加入的总体积为 30 μ I。
[0011]本发明的上述方法中，步骤(2)使用超声波清洗仪时，先向其中加入清水，使水温为14-18°C，再将步骤(I)装有DNA的PCR板放入超声波清洗仪中，使其在清水中漂浮。
[0012]所述清水为双蒸水或去离子水。
[0013]优选地，超声波清洗仪中的水温为16°C。
[0014]为保证PCR板漂浮在水上，本领域技术人员可以采取任何方法实现该目的。在本发明的实施例中，是将PCR板镶嵌入泡沫板的方式使PCR板在水中漂浮。
[0015]本发明方法中，步骤⑵的超声波清洗仪破碎DNA的时间为3-15min。发明人研究发现，若破碎时间>15min，则DNA片段大小将集中在200bp，几乎不再减小，而且该样品测序后数据质量不好。
[0016]具体地，本发明方法中，超声波作用时间与PCR管内预计破碎获得的DNA片段大小对应关系为:3min对应的破碎的DNA片段主带集中在500bp、5min对应的破碎的DNA片段主带集中在300-400bp、1min对应于DNA片段主带集中在300bp、15min对应于DNA片段主带集中在200-300bp。
[0017]本发明提供了上述破碎DNA的方法在构建高通量测序文库中的应用。
[0018]本发明的适用于高通量测序的破碎DNA的方法具有以下优点及有益效果:
[0019](I)破碎DNA片段精准，成功率高。
[0020](2)成本低廉，所采用的仪器和耗材均为常规市售产品，较现有的Covaris公司出品的超声波断裂DNA的仪器操作成本大大降低，平均每个样品的破碎DNA成本不足2元。
[0021](3)本发明方法操作简单，仅需添加样品、调节水温水位，控制超声波作用时间即能短时间内完成20个样品的DNA片段的破碎，且可以多个20孔PCR板连续进行超声波破碎DNA实验，较大幅度地提高了高通量测序过程中建库实验的高通量化。
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例1对水稻DNA样品片段化实验(项目号G87，片段大小为500bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司G87项目的20个水稻样品，Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在500bp。
[0023]图2为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品片段化实验(片段大小为300_400bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在300-400bp。
[0024]图3为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品片段化实验(片段大小为200_300bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在200-300bp。
[0025]图4为Covaris超声波打断DNA片段大小结果电泳图。，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中180bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在200-300bp，300bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在300-400bp，500bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在500bp。
[0026]图5A和图5B为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品在不同体积条件下进行片段化实验电泳图。图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示，在30 μ I体系时，各孔内DNA破碎程度较为均一。
[0027]图6为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品在不同温度条件下进行片段化实验电泳图。图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司10bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示，在16°C时，DNA破碎后弥散条带最接近500bp。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0029]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。超声波清洗仪由江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E或KQ5200E，具有I个换能器，换能器的功率为50瓦。PCR板为Asygen公司PCR_96_C，PCR板中每个PCR孔的容积为200 μ I。
[0030]实施例1本发明的适用于