一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属药物提取纯化技术领域，特别是一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的 提取纯化方法。
【背景技术】
[0002] 龙葵（SolanumnigrumL.)属前科植物，其性寒味苦，微甘，有小毒，归肺、肾二经。 龙葵作为传统中草药在我国各地均有分布，具有清热解毒、消肿散结、消炎利尿的功效。龙 葵多糖对肉瘤S180、胃癌MFC、宫颈癌U14等均有明显的生长抑制作用，能够增加免疫器官 脾脏和胸腺重量，并且能够显著延长荷瘤小鼠的生命周期，且无毒副作用或毒副作用明显 低于传统的化疗药物。但对龙葵多糖的研究，大多集中于粗提取物，对其精制品的分离纯化 工艺的研究未见报道。
[0003] 在传统的方法中，多采用水为溶剂提取获得龙葵粗多糖；但以水为溶剂提取获得 的龙葵粗多糖仍含有蛋白质、色素等杂质，这些成分的存在会影响药物的质量及安全。常用 的脱蛋白方法采用Sevag法时，效率不高，操作需反复多次，成本消耗大、毒性氯仿易残留， 多糖易损失；采用盐酸法时，效果虽好，但强酸性会使部分多糖降解，降低多糖活性；三氟 三氯乙烷法因溶剂沸点低易挥发不宜大量使用，采用酶法脱蛋白时会受到酶的专一性所限 制。
[0004] 基于以上问题，寻找一种工艺简单、成本低、操作方便、得率高、纯度高的龙葵多糖 纯化工艺方法，对于批量生产具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖用于开发抗肿瘤药物尤为重 要。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中的上述问题，本发明针对具有抗肿瘤活性的龙葵多糖为目 标，提供一条简单合理、操作方便、成本低、得率高、纯度高的提取纯化工艺路线。本发明采 用石油醚及乙醇进行脱脂，闪式提取，三氯乙酸脱蛋白，活性炭脱色，二次醇沉等方法制备 龙葵精制多糖。
[0006] 本发明的一个目的在于提供具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法。
[0007]-种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步 骤：
[0008] (1)龙葵粗多糖样品的制备：
[0009] 龙葵饮片40-60°C干燥6_8h后，粉碎过40目筛，制得龙葵粉末；将龙葵粉末加 入4-5重量倍石油醚，于50-55°C水浴条件下，加热回流脱脂2次，每次2h，过滤去液留渣； 将药渣加入2倍重量的80%乙醇，于80°C水浴条件下加热回流2次，每次lh，过滤去液留 渣，药渣晾干，制成已脱脂的龙葵粉末；将上述已脱脂的龙葵粉末置于闪式提取仪的容器 中，加蒸馏水30重量倍，以80V电压闪式提取2次，每次2min;合并提取液，纱布过滤，以 3000r/min离心15min，取上清液减压浓缩至50%药材体积，在搅拌下加入乙醇调节含醇量 至80 %，2-6°C静置冷藏12-24h，减压抽滤，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60°C真空干燥，得龙葵粗多糖；
[0010] ⑵龙葵精制多糖的纯化：
[0011] 将步骤（1)所得的龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1 %的溶液，用 3%-5%三氯乙酸溶液缓缓调节口11至2.5-3.0，振荡处理201^11，2-6°(：静置2-411，以300(^/ min离心lOmin去除胶状蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HC1调节pH至5,40°C保温 脱色20min，静置lh后，以4000rpm/min离心20min除去沉淀；将上清液加入4倍量的95% 乙醇沉淀，2-6°C静置冷藏12-24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗 涤2-3次后，60°C真空干燥得龙葵精制多糖。
[0012] 进一步地，步骤（2)中用三氯乙酸溶液调节pH至2. 5。
[0013] 步骤⑵中活性炭的加入量为待处理液量的0. 7%。
[0014] 本发明所述龙葵饮片是指市售的经过自然或人工干燥的中药龙葵。
[0015] 本发明将龙葵饮片经过预处理、脱脂、提取、脱蛋白、脱色和醇沉的步骤，得到的龙 葵精制多糖。
[0016] 本发明的另一个目的在于提供利用本发明的方法提取的龙葵精制多糖组分在制 备抗肿瘤药物试剂中的应用。
[0017] 龙葵精制多糖的抗肿瘤活性作用：采用MTT法检测利用本发明方法制得的龙葵精 制多糖对肝癌细胞H22体外生长表现出明显的抑制作用，在浓度1. 4-1. 8mg/mL时细胞增殖 抑制率为35. 80-85. 4%，对H22荷瘤小鼠的肿瘤体内生长也表现出明显抑制作用，给药剂 量在30-60mg/kg时肿瘤生长抑制率为37. 73% -42. 60%，而对荷瘤小鼠的胸腺、脾脏等免 疫器官并无不良影响。
[0018] 有益技术效果
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：
[0020] (1)本发明设计了一条工艺简单、操作方便、成本低、得率高、纯度高的龙葵精制多 糖的提取纯化工艺路线，与Sevag法、酶法脱蛋白比较，该工艺路线蛋白脱除率和多糖保留 率均较高。
[0021] (2)本发明在快速高效进行闪式提取龙葵粗多糖的基础上，采用三氯乙酸脱去多 糖水提液中的蛋白质等杂质，采用活性炭脱除色素等杂质，使有效成分的含量提高，有利于 后期产品质量控制。
[0022] (3)本发明通过体外MTT细胞增殖实验和小鼠移植瘤模型动物体内实验，对所获 得的龙葵精制多糖进行了抗肿瘤活性的测定，证实经该提取纯化工艺得到的龙葵精制多糖 具有较强的抗肿瘤活性。
【附图说明】
[0023] 图1是龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制实体图。
【具体实施方式】
[0024]实施例1龙葵精制多糖的制备[0025] (1)龙葵粗多糖的提取：
[0026] 预处理：称取lOOg龙葵饮片（购自浙江嘉信医药有限公司）60°C下6_8h烘干，粉 碎机粉碎过40目筛。
[0027]脱脂：将上述步骤的龙葵粉末加入料液比1:4的石油醚（400ml)，于50°C水浴条 件下加热回流提取2h，共提取2次，过滤弃液留渣。在留下的渣中加入2倍量的80%乙醇 (200ml)，于80°C水浴条件下加热回流lh，共2次，双层纱布过滤，去液留渣，药渣平铺于通 风处晾干。
[0028] 多糖提取：将通风处晾干的药渣置于闪式提取器（JHBE-50T型闪式提取器，公司 名称：河南金鼐科技发展有限公司）内，加水30倍量，以提取电压80V进行闪式提取2min， 共2次，4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心lOmin，得到的水提液，减压浓缩至小体积（至 50ml)，离心取上清液。在搅拌下，向上清液中加入95%乙醇至含醇量为80%，4°C冷藏静置 12h，虹吸上清液弃去，于3000r/min离心15min，将沉淀抽滤，分别依次用无水乙醇（100ml 左右）、乙醚（l〇〇ml左右）洗涤2次，60°C真空干燥至恒重，即得龙葵粗多糖12. 63g，得率 为 12. 63%〇
[0029] (2)龙葵精制多糖的纯化：
[0030]脱蛋白：龙葵粗多糖12. 63g用蒸馏水溶解配成质量浓度为1 %的样品液，缓缓加 入5%三氯乙酸调节pH至2. 5,振荡处理20min，4°C静置4h后，以3000r/min离心lOmin， 去除胶状蛋白沉淀。
[0031] 脱色：将上清液加入待处理液量的0. 7%用量的活性炭，以稀HC1(lmol/L)调节pH 至5,在40°C条件下保温脱色20min，静置lh后以4000rpm/min离心20min，除去活性炭沉 淀，留上清液。
[0032] 醇沉：将上清液，加入4倍量的95%乙醇沉淀，2-6°(：静置冷藏2411，以4000印111/ min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60°C真空干燥得龙葵精制多糖。 经测定蛋白质脱除率为90. 93%，多糖保留率为90. 83 %，精制多糖质量为2. 554g，得率为 2. 554%〇
[0033] 实施例2龙葵精制多糖的制备
[0034] (1)龙葵粗多糖的提取：
[0035] 称取100g龙葵饮片60°C6_8h烘干，粉碎机粉碎过40目筛，加入料液比1:4的石 油醚，50°C水浴加热回流提取2h，共提取2次，过滤弃液留渣，加入2倍量的80 %乙醇，于 80°C水浴条件下加热回流lh，共2次，双层纱布过滤，去液留渣，药渣平铺于通风处晾干。然 后将药渣置于闪式提取器内，加水30倍量，以提取电压80V进行闪式提取2min，共2次，4 层纱布过滤，滤液于3000r/min离心10min，得到