对蜂房哈夫尼亚菌g5897，g5898，g5900特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特异的核苷酸，尤其涉及对蜂 房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900的0抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 蜂房哈夫尼亚菌（Hafniaalvei)为肠杆菌科中的一种，菌体呈直杆状，无荚膜，能 动，兼性厌氧，有呼吸和发酵两种类型的代谢方式，在人类呼吸道、肠道，动物肠道和肉类奶 制品等食物中较为为常见。蜂房哈夫尼亚菌是一种条件致病菌，该菌在免疫力低下的人群 中可以引起菌血症，呼吸道感染，尿路感染及其他感染，它可能与肠胃炎有一定关系，此外， 还可以导致蛋鸡的卡他性肠炎和肝脾肿大，保加利亚虹鳟鱼中动物流行性败血病等动物疾 病。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的〇抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 蜂房哈夫尼亚菌的表面抗原，既有0抗原也有H抗原，但是主要用0抗原进行分 型，并且0抗原研究的比较透彻。目前已确定蜂房哈夫尼亚菌的正式血清型方案是由俄罗 斯莫斯科研究疫苗和血清的梅契尼科夫研究所的一个实验室提出的，确认了 39个0和36 个H型。这种分类方法一直是研究菌株间流行病学关系的首选方法，并且在比对来自不同 地方不同时间的菌株方面尤为有用。对于其分子鉴定也越来越受到人们的重视，分子生物 学检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展 方向。
[0005] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于蜂房哈夫尼亚菌的快速血清分型筛查， 稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚 酶链式反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快 速、灵敏、特异性强等优点。
[0006] 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA 模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含 有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1. 5小时。这对检验检疫部门和临床 检验无疑是极大提高了工作速度，同时也降低了工作成本。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了本发明涉及对蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特 异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1)SEQIDN0:1-6所示的核苷酸中的一种； 2) 与SEQIDN0:1-6所示的核苷酸互补的核苷酸中的一种；所述的SEQIDN0:1-6如 下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDN0:1-6所示的核苷酸中的一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10mM dNTP30y1 ;10X酶特异性反应缓冲液50y1 ;5U/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;混合引物 10yl(各标准菌株特异的上下游引物，单数为上游引物，双数为下游引物G5897为SEQID NO: 1-2 ;G5898 为SEQIDNO:3-4 ;G5900 为SEQIDNO:5-6);阳性对照品 10y1 引物；阴性 对照品l〇y1 ;ddH20 5ml。
[0008] 其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO: 1-6所示的核苷酸中的一种。
[0009] 本发明进一步公开了对蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特异的SEQID NO: 1-6核苷酸在制备用于检测蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900的PCR试剂盒。
[0010] 本发明所述蜂房哈夫尼亚菌指的是取样于败血症、尿道感染、伤口感染等临床标 本培养物的粗提液或是蜂房哈夫尼亚菌的纯培养物的粗提液。收集蜂房哈夫尼亚菌并提取 基因组是米用常规方法制备获得。
[0011] 针对蜂房哈夫尼亚菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳 检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理 后的样本加入扩增管，启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
[0012] 本发明还提供一种液相检测芯片，包括液相磁珠和连接在液相磁珠上的寡核苷酸 探针，以及相应探针所在片段所对应的相应引物；其中所述核苷酸优选为如SEQIDN0:1-6 所示的核苷酸。
[0013] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ IDN0:1-6所示的核苷酸。
[0014] 本发明进一步公开了对蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特异的核苷酸在制 备用于检测蜂房哈夫尼亚菌PCR试剂盒、检测蜂房哈夫尼亚菌的基因芯片方面、检测蜂房 哈夫尼亚菌微阵列方面的应用。所述的检测蜂房哈夫尼亚菌指的是检测引起支气管炎，肺 炎，尿路感染，伤口感染和败血症的细菌。
[0015] 本发明公开的对蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特异的核苷酸与现有技术 相比，本发明具有如下优点： (1)实用性强 本发明建立的一种PCR反应体系，可检测蜂房哈夫尼亚菌，提供血清分型检测所用到 的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。
[0016] (2)准确性高 本发明通过对蜂房哈夫尼亚菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条 目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到蜂房哈夫尼亚菌所对应菌株编 号。
[0017] (3)检测成本相对较低 可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品监测检验检疫等领域，并为其他不同致 病菌检测组合提供技术模式。
[0018]
【附图说明】： 图1表示本发明G5897特异引物检测蜂房哈夫尼亚菌及其他标准菌株电泳结果图，r好 基因P1和P2目的条带为287bp，其余的菌株没有任何条带，具体菌株信息见表2; 图2表示本发明G5897特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 6株弧菌以 及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本发明G5898的r幻基因P3和P4引物检测蜂房哈夫尼亚菌及其他标准菌株 电泳结果图，目的条带为241bp，具体菌株信息见表2 ; 图4表示本发G5898的wzy基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测 了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表； 图5表示本发G5900的r幻基因P5和P6引物检测蜂房哈夫尼亚菌及其他标准菌株电 泳结果图，目的条带为286bp，其余的菌株没有任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图6表示本发明G5900的r幻基因P5和P6引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图7表示分别用蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900特异引物扩增对应血清型的电泳 结果图，具体菌株信息见表2; 其中：蜂房哈夫尼亚菌G5897,G5898,G5900表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳 道是 2000bpDNAmarker或者lkbPlusDL〇
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。其中蜂房哈夫尼亚菌来源于波兰华沙（PCM，Polish CollectionofMicroorganismsatIITDPAN,Wroclaw)。
[0020] 实施例1:基_组的提取 37°C营养肉汤培养基培养蜂房哈夫尼亚菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和 10ul0. 4MEDTA重悬细胞，37°C温育 20 分钟，然 后加入lOullOmg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul10%SDS，50°C温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65°C温育30分钟。加等体积酚 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0021] 实施例2:序列破译 提取蜂房哈夫尼亚菌G5897，G5898，G5900标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测序技术对蜂房哈夫尼亚菌各标准基因组进行全基因组测序获得该〇血清型的序列，运用 Blast及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMMServer2.0program进行跨膜结构预测，运 用ClustalWprogram进行序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得蜂房哈夫尼亚菌 各个血清型的0抗原基因簇序列及破译结果。
[0022] 实施例3:引物设计 根据基因簇破译情况和建库比对结果，发现wzy和wzx基因是蜂房哈夫尼亚菌0抗原 特异的基因，所以选取该基因特异区段设计特异引物。由于wzy更加特异，所以主要以wzy 基因为靶基因。
[0023]引物设计是该发明的核心部分