抗猪生殖与呼吸综合征病毒的动物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请为2012年5月16日提交的，发明名称为"抗猪生殖与呼吸综合征病毒的动 物"的PCT申请PCT/US2012/038193的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为 2013 年 11 月 15 日，申请号为 201280023487. 4。
[0002] 政府支持
[0003] 本发明是在由农业部授予的合同号（USDA/ARS) 58-1940-8-868的政府支持下进 行。政府具有本发明的某些权利。
[0004] 序列表
[0005] 本申请含有2012年5月15日生成的标题为"UM0 11053.WOSEQ_ST25"的序列表， 其据此通过引用整体并入。
技术领域
[0006] 本发明通常涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失 活和/或⑶163基因的至少一个等位基因已经失活。还提供了产生此类转基因猪的方法。
[0007] 发明背景
[0008] 猪生殖与呼吸综合征病毒是猪经济上最重要的疾病之一。1987年在美国 (Keffaber1989)和1990年在欧洲（Wensvoort等1991)首先检测到这种疾病。对原型 PRRS病毒（PRRSV)VR-2332和雷皇斯塔德（Lelystad)(分别为美国和欧洲分离株）的分子 分析已经表明，趋异进化菌株几乎同时出现在两个大洲，这可能是由于猪管理实践上的类 似变化（Murtaugh等1995 ;NelSen等1999)。自从其最初出现以来，这种病毒就在世界范围 内传播，并且在美国猪群中已经检测到欧洲基因型的PRRSV(Ropp等2004)。PRRS的特征在 于严重且有时致命的呼吸道疾病和生殖障碍，但是也使受感染猪易感染细菌性病原体以及 其它病毒病原体（Benfield等1992)，并且是经济显著的猪呼吸系统疾病综合征（PRDC)的 主要组成部分。急性感染期间PRRSV引起的最一致的病理损伤是间质性肺炎和轻度淋巴细 胞性脑炎（Plagemann1996)。在特征为病毒血症和临床疾病的PRRSV感染的急性期后，许 多猪完全恢复，然而在较长一段时间携带低水平病毒感染。这些"载体"猪受PRRSV持续感 染并且间歇或连续地传播病毒，并且可能在直接或间接接触后感染未实验的猪。在实验条 件下，受PRRSV持续感染也有良好的文档记录（Albina等1994 ;Allende等2000;Benfield 等 1998;Christopherhennings等 1995;Sur等 1996;Yoon等 1993)。最显著的是，已经在 感染157天后回收了传染性病毒（Wills等1997)。虽然也已经证实肺细胞和睾丸的上皮生 殖细胞受感染（Sur等1996 ;Sur等1997)，但是组织巨噬细胞和单核细胞是急性和持续感 染期间的主要靶细胞（Molitor等1997)。
[0009]PRRS的病原是为巢状病毒母（orderNidovirales)动脉炎病毒科 (Arteriviridaefamily)成员的被膜的正链RNA病毒。动脉炎病毒科的其它成员包括小鼠 乳酸脱氢酶增高病毒（LDV)、马动脉炎病毒（EAV)和猿出血热病毒（SHFV)。对基因组序列 数据的分析显示PRRSV菌株间的广泛多样性，但是也显示出非常保守的结构域（Andreyev 等1997;Meng2000 ;Meng等1995)。PRRSV的基因组构成与其它动脉炎病毒的基因组构成 类似，对于ORFla复制酶蛋白而言基因组RNA起信使RNA作用（Plagemann1996)。ORFla和lb包含约80%的病毒基因组并且编码RNA依赖性RNA聚合酶以及加工成其它非结构蛋 白的多蛋白（Snijder和Meulenberg1998)。使用雷皇斯塔德病毒，已经确定0RF2-7编码 病毒结构蛋白。ORF5(GP5)和M编码的蛋白（VanBreedam等2010b)在PRRSV诱导凋亡 中起作用（Suarez等1996 ;Sur等1997)并且被认为是密切相关的乳酸脱氢酶增高病毒中 的病毒吸附蛋白。PRRSV的较小包膜糖蛋白GP2a和GP4与CD163相互作用（Das等2010)。 有数据表明，与SIGLECU唾液酸结合性Ig样凝集素1)结合是进入细胞所必需的，并且实 际上对于病毒感染而言似乎需要与SIGLEC1和⑶163双重结合（VanGorp等2008)。
[0010] PRRSV致病原因（特别是在分子水平上）和动物流行病学的许多特征知之甚少，因 此使得控制工作很困难。为了获得更好的理解，已经研发了PRRSV的传染性克隆（Nielsen 等2003)。现今生产商常常用改良-活减毒菌株或灭活病毒疫苗为猪接种PRRSV疫苗。然 而，由于菌株变异和免疫系统的刺激不足，当前的疫苗往往并未提供令人满意的保护。因 为已经证明，在用PRRSV的同源菌株激发猪时先前接触可提供完全保护，所以保护性免疫 反应是可能的（Lager等1999)。然而，从未对用异源菌株激发一致性证明保护性免疫。除 担心可用PRRSV疫苗的功效外，有强有力的证据表明，如在实验感染猪后用毒性野外分离 株所证明的那样（Rowland等1999)，目前使用的改良-活疫苗可继续存在于个别猪和猪群 中并积累突变（Mengeling等1999)。此外，已经证实疫苗病毒是在接种公猪的精液中传播 (Christopherhennings等1997)。作为接种疫苗的替代方案，一些专家正提倡生殖群中的 "试验和去除"策略（Dee和Molitor1998)。这种策略的成功使用取决于去除受PRRSV急性 或持续感染的所有猪，接着严格控制以防再引入病毒。与这种策略相关的困难和大部分费 用是，对持续性PRRSV感染的致病原因知之甚少，因此没有可靠技术鉴定受持续感染的猪。
[0011] 已经用单克隆抗体鉴定了PRRSV的假定细胞受体，纯化并测序（Vanderheijden等 2003 ;Wissink等2003)并且命名为SIGLEC1。这种分子与唾液酸粘附素有相似性并且经 证实介导PRRSV进入非易感细胞，但是表达这种受体的重组细胞系不能支持PRRSV的生产 性复制（Vanderheijden等2003)。重要的是，已经证实感染肺泡巨噬细胞需要PRRSV表面 存在的唾液酸分子。病毒与这种受体结合后，PRRSV的进入通过受体介导的胞吞作用发生 (Nauwynck等1999)。通过实验确定唾液酸粘附素对PRRSV进入的关键作用，其中证明在感 染克隆猪唾液酸粘附素的PK15细胞（不容许PRRSV复制的细胞系）中，而不是未感染的对 照PK15细胞中病毒吸收（Vanderheijden等2003)。这同一组的进一步研究证明，PRRSV病 毒粒子表面的唾液酸与唾液酸粘附素分子的相互作用对于PRRSV感染肺泡巨噬细胞是必 需的（Delputte和Nauwynck2004)。相反的策略，即去除PRRSV表面的唾液酸或用唾液酸 特异性凝集素预培养也导致感染中断（Delputte等2004 ;Delputte和Nauwynck2004;Van Breedam等2010b)。不依赖于对PRRSV进入的具体研究，已经使用定点诱变鉴定鼠唾液酸粘 附素结合唾液酸所需的六个关键氨基酸残基（Vinson等1996)，其与猪唾液酸粘附素69% 相同。重要的是，鼠唾液酸粘附素中鉴定的6个氨基酸在猪分子中也全部保守。
[0012] SIGLEC1是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的跨膜受体。最初将其描述为 小鼠巨噬细胞的绵羊红细胞结合受体（Crocker和Gordon1986)。其在造血和淋巴组织中 的巨噬细胞上表达。SIGLEC由含有唾液酸结合位点的N端V-集结构域组成，后面是数量可 变的C2-集结构域，然后是跨膜结构域和胞质尾区。与SIGLEC相反，SIGLEC1在胞质尾区内 没有基于酪氨酸的基序（Oetke等2006)。唾液酸结合位点映射到N端免疫球蛋白样V-集 结构域（Nath等1995)。R116残基似乎是对于唾液酸结合而言重要氨基酸之一（Crocker 等1999 ;Delputte等2007)。因此，完整的N端结构域对于PRRSV与SIGLEC1结合充分必 要（VanBreedam等2010a)。报道了小鼠中SIGLEC1的敲除并且产生能活且能生殖，并且未 显示出发育异常的小鼠（Oetke等2006)。然而，这些小鼠的B和T细胞群有微小变化并且 免疫球蛋白M水平降低。
[0013] PRRSV的感染过程从与肺泡巨噬细胞表面的硫酸乙酰肝素首次结合开始。然后与 唾液酸粘附素（SIGLEC1，也称为⑶169或SN)发生稳固结合。然后通过网格蛋白介导的胞 吞作用使病毒内在化。然后另一分子，CD163,促进核内体中的病毒脱壳（VanBreedam等 2010a)。病毒基因组释放并感染细胞。
[0014] ⑶163具有17个外显子并且蛋白质由具有9个清道夫受体富半胱氨酸（SRCR)结 构域的胞外区、跨膜片段和短胞质尾区构成。由单个基因的不同剪接产生几种不同的变异 体（Ritter等1999a;Ritter等1999b)。大部分这种变异被认为是由胞质尾区的长度引起 的。
[0015] ⑶163有许多重要功能，包括用作触珠蛋白-血红蛋白清道夫受体。因为血红素 基可能极具毒性，所以清除血液中的游离血红蛋白是⑶163的重要功能（Kristiansen等 2001)。CD163具有促进胞吞作用胞质尾区。这种尾区的突变导致触珠蛋白-血红蛋白复合 物吸收减少（Nielsen等2006)。C163的其它功能包括成红细胞粘附（SRCR2)，为TWEAK受 体（SRCR1-4和6-9)、细菌受体（SRCR5)、非洲猪病毒受体（Sanchez-Torres等2003)和作 为免疫调节剂的潜在作用（在（VanGorp等2010a)中有讨论）。
[0016] 发明概述
[0017] -方面，本发明是一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因 已经失活和/或⑶163基因的至少一个等位基因已经失活，其中⑶163等位基因的失活产 生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
[0018] 本发明的另一方面是一种其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经 基因修饰的猪，通过包括以下的方法产生：为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪 成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；和激活 所述卵母细胞以产生胚胎。
[0019] 本发明还涉及一种其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰 的猪，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV) 脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：为猪卵母细胞去核； 使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活 CD163等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
[0020] 另一方面，本发明是一种其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修 饰的猪，通过包括以下的方法产生：使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的 经基因修饰的公猪与其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母 猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已 经失活的经基因修饰的猪。
[0021] 本发明的另一方面是提供一种其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基 因修饰的猪，通过包括以下的方法产生：使其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活 的经基因修饰的公猪与其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母 猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中⑶163基因的两个等位基因已经 失活的经基因修饰的猪。
[0022] 本发明还涉及其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已 经失活的经基因修饰的猪，其中⑶163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼 吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的⑶163蛋白，所述经基因修饰的猪通过三种方法的任一种产 生。第一种此类方法包括使具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪与具有 至少一个失活⑶163等位基因的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子 代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且⑶163基因的至少一个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪。这种方法进一步包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等 位基因已经失活并且⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交 配以产生F2子代并且筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163 基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
[0023] 第二种此类方法包括使其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修 饰的猪与其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代， 使F1子代交配以产生F2子代，并且筛选F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因 和⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
[0024] 第三种此类方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和⑶163基因的至 少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基 因和⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且 筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经 失活的经基因修饰的猪。
[0025] 本发明还涉及上述任一经基因修饰的猪的子代，其中：（l)SIGLECl基因的至少一 个等位基因已经失活；（2)⑶163基因的至少一个等位基因已经失活；（3)SIGLEC1基因的至 少一个等位基因和⑶163基因的至少一个等位基因已经失活；或（4)SIGLEC1基因的两个等 位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失活。在其中⑶163基因的一个或两个等位基因 已经失活的此类子代中，失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱 壳的CD163蛋白。
[0026] 本发明还涉及一种产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基 因修饰的猪的方法。所述方法包括为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细 胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；和激活所述卵母 细胞以产生胚胎。
[0027] 再一方面，本发明为一种产生其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经 基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综 合征病毒（PRRSV)脱壳的CD163蛋白。这种方法包括为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞 与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活CD163等位基因； 和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
[0028] 本发明还涉及一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修 饰的猪的方法。所述方法包括使具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的母猪 与具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代，并且筛选 所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
[0029] 本发明还涉及一种产生其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰 的猪的方法，其中⑶163等位基因的失活产生不能结合和/或使PRRSV脱壳的⑶163蛋白。 这种方法包括使具有至少一个失活⑶163等位基因的经基因修饰的母猪与具有至少一个 失活⑶163等位基因的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴 定其中⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
[0030] 本发明的另一方面是一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的 两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结 合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的CD163蛋白。所述方法包括使具有至 少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪与具有至少一个失活⑶163等位基因的经 基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少 一个等位基因已经失活并且⑶163基因的至少一个等位基因