一种快速检测母猪卵母细胞质量的microRNA分子标记miR-23a及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种快速检测母猪卵母细胞质量的miRNA 分子标记miR-23a、amiR-23a的引物、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 养猪场的经济效益高低与母猪繁殖率有着根本关系。母猪的繁殖性能是衡量养猪 生产中的一个重要经济指标。在养猪生产中除了充分发挥和利用母猪的繁殖性能，还需要 及时淘汰生产性能低下母猪，才能实现经济效益的最大化。如何尽早淘汰生产成绩不佳母 猪，成为了困扰养猪生产的一道难题。研究发现母猪卵母细胞质量与生产成绩成正相关关 系。因此通过检测母猪卵母细胞质量是最准确、最有效评价母猪生产成绩的方法。但是目 前对母猪卵母细胞质量检测方法都停留在实验室阶段，并且都会对母猪造成伤害，对于生 产并无指导意义。
[0003]miRNAs是一类长度为19-25个核苷酸非编码小RNA，在进化过程中高度保守、并在 各组织细胞中特异性表达。越来越多研究发现miRNAs通过转录后调控基因表达参与多种 生物学信号通路的调节。越来越多研究证据已经表明miRNA作为一种调控因子在调节卵母 细胞成熟、黄体发育、早期胚胎发育及胚胎着床等过程中发挥重要作用，并且在很多与卵巢 相关疾病的发生和发展过程中扮演极其重要角色，可以用来预测不孕、卵巢癌、多囊卵巢综 合征发生的分子标志物。
[0004] 研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs可稳定存在于 循环中，且不易被内源性RNA酶所降解。有研究发现经RNA酶处理的血清和细胞RNA提取 物，大分子的RNA全部降解，但miRNAs仍较好地保持稳定和完整性，miRNAs还可抵御多种 恶劣外环境如煮沸、过高或过低的PH值、反复冻融，对储存条件要求亦不严格。miRNAs在同 一样本表达水平保持恒定，反复检测同一标本miRNAs含量，结果稳定。现有的成熟的技术， 包括定性和定量miRNA分子的技术，表明血清miRNAs可以作为一种非常准确和有效，并且 可以适用养猪生产的分子生物标志物。
[0005] 有研究结果表明，血清中miRNA分子是由组织中的miRNA主动分泌而获得的，因此 可以通过高通量芯片分析发育潜能差的卵母细胞中miRNA的表达谱变化来筛选血清中的 miRNA，再结合母猪生产成绩，大样本分析猪群血清异常表达的miRNA水平变化。这将是一 种非常有效的筛选分子标记物的方法。
[0006] 通过检测卵母细胞质量预测母猪繁殖潜能，尽早淘汰生产潜能低的母猪，这将大 大降低饲料和人力成本，有助于我国生猪产业的蓬勃发展。因此开发一种适合猪场，无创并 可以准确检测母猪卵母细胞质量的分子标志物至关重要。
【发明内容】
[0007] 本发明针对上述存在的问题作出改进，提出一种快速检测母猪卵母细胞质量的血 清miRNA标记。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明通过microRNA基因芯片从发育潜能低的卵母细胞中筛选出异常高表达的 microRNA，并通过realtimePCR验证，最终明确miR-23a与卵母细胞质量高度相关，可以作 为快速检测卵母细胞质量的标记物。
[0010] 因为发育潜能低卵母细胞中异常高表达的miR-23a可以通过组织的主动分泌过 程分泌到血清中，所以本发明重点分析了生产成绩低下母猪血清miR-23a的成熟体（其序 列为5' -AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3'，如SEQIDN0 :1所示）的表达情况，首次发现血清 miR-23a可以作为快速检测母猪卵母细胞质量分子标志物进行应用。具体应用时，在母猪出 现静立反射的第二天早上空腹采集血样，采用RealtimePCR检测血清中miR_23a的表达水 平，若能检出，则该母猪应该被淘汰。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种用于快速检测母猪卵母细胞质量的miRNA分 子标记miR-23a，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO: 1所示，所述分子标记miR-23a在发育潜能差卵丘卵母细胞中异常高表达，并通过组织的主动分泌过程分泌到血 清中；分泌至血清中的核苷酸分子标记miR-23a用于母猪卵母细胞质量的快速检测。
[0012] 为实现上述目的，本发明还提供了用于检测所述分子标记miR_23a引物对，核苷 酸序列如下：
[0013]正向引物：5' -ATCACAITGCCAGGGAITTCC-3'，如SEQIDN0. 2 所示；
[0014] 逆向引物序列为通用的适配子引物。
[0015] 所述引物对特异性扩增出SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0016] 为实现上述目的，本发明还提供了一种用于快速检测母猪卵母细胞质量的试剂 盒，包括上述引物对。
[0017] 所述试剂盒还包括2. 5U/y1PolyA聚合酶、逆转录酶、5X逆转录缓冲液、去RNA 酶水、2XqPCR混合液、70 %乙醇、血清裂解液、氯仿和无水乙醇。
[0018] 所述试剂盒的具体组成如下：
[0019] 2. 5U/y1PolyA聚合酶 20y1;
[0020] 逆转录酶20y1 ;
[0021] 5X逆转录缓冲液100y1 ;
[0022] 去RNA酶水 1000y1 ;
[0023] 2XqPCR混合液 2000y1;
[0024] 50um上游特异引物20y1;
[0025] 50um下游适配引物20y1;
[0026] 内参上游引物20yl;
[0027] 内参下游引物20yl;
[0028] 血清裂解液100ml ;
[0029] 70 % 乙醇 100ml;
[0030]氯仿 100ml;
[0031] 无水乙醇100ml。
[0032]采用上述试剂盒检测miR_23a的具体方法为：
[0033] (l)microRNA的提取：
[0034] ①取母猪的外周血血清400y1，加入750y1裂解液MRL，吹打几次，剧烈震荡混 勾，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNase free的离心管中。
[0035] ②加lmLTrizol试剂，混勾，室温下放置10分钟。4°C12000rpm离心15分钟。
[0036] ③取上清液到1. 5mL的去RNase的EP管中，加入200 y 1氯仿，剧烈振荡混匀30 秒，使水相和有机相能充分混合，室温静置15分钟，4°C 12000rpm冷冻离心10分钟。
[0037] ④吸取上层水相部分移至另一个新的去RNase的EP管，加入0.5mL异丙醇，震荡 混匀后室温下静置10分钟，4°C 12000rpm冷冻离心10分钟。
[0038] ⑤去上清，加入70%乙醇以沉淀RNA成份，并加入适量的DEPC水将其溶解。
[0039] (2)miR_23a的检测：
[0040] ①按照得到的RNA+逆转录缓冲液5y1+逆转录酶1y1+2. 5U/y1聚合酶1y1+ 去RNA酶水补足到25y1。
[0041] ②37°C水浴60min;85°C水浴5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA。
[0042]③cDNA2yl+2xqPCR混合液 10y1+ 引物（2yM) 2y1+ 通用引物（2yM) 2y1+DDW 4y1〇
[0043] ④预变性95°ClOmin-(变性15秒一退火60°C20秒一延伸72°C30秒）40个 循环，结束后立即进行融解曲线分析，溶解曲线选择自动程序：具体过程为：95°C15秒， 60°C1 分钟，95°C15 秒，60°C15 秒。
[0044] ⑤根据得到的Ct值，减去内参基因，代入2-A ACT，得到miR_23a在该母猪血清中 的表达值。
[0045] 为实现上述目的，本发明还提供了一种用于检测血清miR_23a成熟体的特异性扩 增的方法，包括如下步骤：首先进行血清microRNA的抽提，然后在poly(A)聚合酶在其3' 末端加polyA尾，在反转录酶的作用下反转录为cDNA，并进行RealtimePCR扩增。
[0046] 为实现上述目的，本发明还提供了下述任一应用：
[0047](1)上述的分子标记在检测卵母细胞质量预测母猪繁殖潜能中的应用；
[0048] (2)上述的引物对在检测卵母细胞质量预测母猪繁殖潜能中的应用；
[0049] (3)上述的试剂盒在检测卵母细胞质量预测母猪繁殖潜能中的应用；
[0050] (4)上述的方法在检测卵母细胞质量预测母猪繁殖潜能中的应用。
[0051] 本发明的有益效果：
[0052] 本发明利用microRNA基因芯片检测和比较发育潜能差和发育潜能高的母猪卵母 细胞microRNA表达谱差异，从中筛选出候选microRNA，通过realtimePCR进行验证，发现 miR-23a可以作为检测卵母细胞质量的分子标记物。异常高表达的miR-23a可以通过组织 的主动分泌过程分泌到血清中，因此随后大样本分析了生产成绩低下母猪血清miR-23a表 达水平，发现血清miR-23a是一种可以快速检测母猪卵母细胞质量的分子标记物。本发明 提供的这种miRNA分子作为快速检测母猪卵母细胞质量的分子标志物，对预测母猪生产潜 能具有重要意义。
【附图说明】
[0053] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0054] 图1为发育潜能低卵丘卵母细胞及正常对照组miRNA表达分析；
[0055] 图2为卵母细胞质量差母猪及正常对照组血清miRNA表达分析。
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057] 实施例1芯片法比较发育潜能低下卵丘卵母细胞miRNA表达谱变化差异
[0058] 从屠宰场采集商品肉猪卵巢，卵巢在37°C无菌生理盐水中尽快运回实验室。用 20号针头的无菌注射器抽取卵巢表面直径在2-6_的卵泡，将抽取的卵泡液缓缓注入高压 灭菌过的离心管，使卵母细胞自然沉降10分钟，然后用移液器缓缓吸取卵泡上清液，将移 去上清后的沉淀转移到含有PBS缓冲液的60mm培养皿中。在体视显微镜下用口吸管将卵 丘卵母细胞分为两类转移到lml离心管中，-70°C保存待测。分类标准：发育潜能低下卵丘 卵母细胞：卵母细胞胞质均匀，仅有单层卵丘细胞或无卵丘细胞包被。正常对照组：卵母细 胞质均匀，周围有4层以上卵丘细胞包被。
[0059] 按照下述方法提取卵丘卵母细胞中RNA。
[0060] ①卵丘卵母细胞直接加入Trizol，按0.lg加入lmLTrizol溶液，颠倒混勾，室 温静置5min;
[0061] ②每lmLTrizol加0? 2mL氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃15sec，使其充分混匀， 室温静置5min后12000rmp离心15min;
[0062] ③将上层水相转入新的