快速鉴定兰属植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种快速鉴定兰属植物的方法，属于植物鉴定技术领域。
【背景技术】
[0002] 20世纪末，兰花业发展迅速。栽培群体迅速扩大，新品种层出不穷。品种分类方面 仍以传统瓣型分类为主，现代新兴技术和手段也有所尝试。运用数量分类方法对中兰花品 种分类的研究，R分析初步得出了兰花花种级分类的特征性状和品种分类特征性状，Q分析 得出了兰花花种级分类界线和类型分级界线。这是兰花品种分类运用现代技术取得的最大 成果，也对经典形态分类提供了有力的佐证。国际上，有关兰花品种分类的工作非常少，仅 限于日本和韩国方面。其现有兰花品种中有多数均为中国原有品种；品种分类也是对中国 传统瓣型分类的延续。同时，随80年代后中国南方多省对兰花叶艺观赏的兴起，日本、韩兰 花花界人士对兰花叶艺类别的说明多见，但作为非主流分类方法，并未有相关系统分类出 现。目前，尚无系统全面的对莲瓣兰品种分类研究的相关报道。
[0003] 自二十世纪90年代以来，植物分子系统学蓬勃发展，其理论和方法已日益成熟和 完善，相对于形态性状，特别是数量性状，分子标记和DNA测序有许多无可比拟的优点。生 物大分子本身就是遗传进化信息的载体和进化历史的累积，信息量大，其变异一般不易受 环境影响而相对稳定，趋同效应弱，所提供的系统进化信息更接近客观自然，所揭示系统发 育关系也更具客观性和可比性。基于基因和DNA片段变异或者序列碱基变异位点检测值为 基因组的遗传变异，并根据所提供的信息进行系统发育分析已成为目前植物系统学研究的 主要手段，广泛地应用于植物系统的各级分类单元上，并取得了重要的研究成果。
[0004]SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定植物不同品种的新方法。SCAR标记是 以品种的特异序列为基础，通过对特异序列设计引物，其PCR结果是一种显性标记，在电泳 图谱上一般表现为特异片断的有无。SCAR标记应用于品种鉴别时仅需从标准样品中选择阳 性和阴性两个品种作为对照即可。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种通过SCAR标记，得到兰属植物DNA特异条带，用以快速 鉴定兰属植物的方法。
[0006] 一种快速鉴定兰属植物的方法，其特征在于通过植物基因组DNA的CTAB法提取兰 属植物基因组DNA，通过兰属植物的随机引物BS-5的RAH)扩增反应，以及SCAR标记引物的 PCR扩增反应，通过电泳检测观测扩增后的PCR产物条带，兰属植物样品都具有约1070bp的 特异性条带。
[0007] 所述的随机引物BS-5的RAH)扩增反应引物序列为： BS-5 :5'-TGCGCCCTTC-3' 。
[0008] 所述的SCAR标记引物的PCR扩增反应引物序列为： SF: 5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3' SW: 5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3' 。
[0009] 本发明快速鉴定兰属植物的方法，具体通过下列步骤实现： 一.提取兰属植物基因组DNA 1) 提取DNA所用的提取液，吸头，离心管等需要在高压灭菌锅中121°C(约1. 1kg/cm) 高压灭菌20min; 2) 取50mg新鲜的叶片用液氮研磨，磨碎后置于1. 5ml离心管中，加入预热的600yL 2XCTAB缓冲液（lOOmMTris-Hcl，pH=8.0;20mMEDTA，PH=8.0;1.4MNaCl;2%CTAB; 2%0-巯基乙醇；5%PVP); 3) 65°C温浴lh，每隔lOmin轻缓颠倒离心管，使其混匀； 4) 12, 000rpm/min离心lOmin，上清液转入另一干净离心管中； 5) 分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)，氯仿：异戊醇（24:1)各抽提一次。 12, 000rpm/min离心lOmin; 6) 上清液转管，加入等体积的冷的异丙醇，_20°C沉淀2h; 7) 12, 000rpm/min离心lOmin，弃上清液； 8) 沉淀分别用70%乙醇，无水乙醇各洗涤一次； 9) 将沉淀置于超净工作台上吹干，加入50yL1xTE(10mMTris-Hcl，pH=8.0; ImMEDTA)溶解，放在-20°C备用。
[0010] 二?SCAR标记的兰属特异片段的扩增 1)随机引物BS-5的RAH)扩增反应 引物序列： BS-5 :5'-TGCGCCCTTC-3' PCR反应体系25yL: DNA模板 LOyL TaqDNA聚合酶（5U/yL，Takara) 0. 25yL 2. 5mmol/LdNTPs 2. 0yL 10XPCRBuffer(含Mg2+) 2. 5yL BS5 (lOmM/yL) 1. 5yL ddH20 17. 75yL 总体积 25yL PCR的扩增程序：
[0011] 2)随机引物BS-5扩增产物的电泳检测 取10 y L的PCR产物和5 y L Trans 2K Plus DNA Marker分别与2 y L的6 X上样缓冲 液（25 y L/L花青素）混合均匀后上样，在1 X TAE缓冲液体系中，经1. 5%琼脂糖凝胶，100V 电泳lh ;然后将胶放入IQuant capture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，观察PCR产 物条带。
[0012] 3)特异片段的回收 生工生物工程(上海)有限公司Sanpr印柱式DNA胶回收试剂盒进行特异性片段的割胶 回收。
[0013] (1)用1% (w/v)琼脂糖凝胶，于新配制的TAE缓冲液中电泳分离PCR扩增产物； (2) 紫外灯下切下目的DNA片段，应尽量减少DNA暴露在短波紫外灯的时间以降低对 DNA的损伤； (3) 将切割的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶收集于1. 5ml的离心管中，称重，并按照 lg/lml的比例换算出胶的体积； (4)向离心管中加入Binding BufferII，加入的量为胶体积的3-4倍； (5) 将离心管置于55°C水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化； (6)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，室温放置2min, 8,OOOrpm离心lmin。倒掉收集 管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中； (7)向吸附柱中加入500yLWash Solution，室温放置2min，10,OOOrpm离心lmin。倒 掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，重复该过程一次； (8) 将空吸附柱和收集管放入离心机，12, 000离心2min，除去吸附柱上残留的乙醇； (9) 将离心后的吸附柱自然晾干10min，使乙醇挥发完全； (10) 将吸附柱置于一新1.5ml离心管中，加入30-50yLElutionBuffer，室温静置 l_2min，12, 000 离心lmin; (11) 所提DNA经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，取1yLDNA和30ng未经酶解的ADNA标准 分别与2yL的6X上样缓冲液（25yL/L花青素）混匀后上样，在1XTAE缓冲液体系中， 120V电泳lh;然后将胶放入IQuantcapture凝胶成像分析系统中，进行分析并拍照，比较 样品DNA条带与ADNA标准条带的亮度和宽度即可对样品DNA含量进行估计； 4)PCR产物的连接 将PCR产物连接到pMD18-T载体上(购自上海生工生物工程有限公司） 反应体系10yL: pMD18-T vecter 0. 5 u L Soloution I 1u L 纯化后的PCR产物 5yL ddH20 3. 5 y L 16°C连接过夜。
[0014] 5)大肠杆菌感受态细胞的制备 采用CaCV法，制备感受态细胞的大肠杆菌宿主菌株为DH5a。方法如下： (1) 挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于50mL的LB液体培养基中，37 °C振荡培养过 夜； (2) 取该菌液以1:100接种于10mL新鲜LB培养液中，37°C剧烈振荡培养至0D6QQ=0. 4~ 0. 6 (或菌液成轻微云雾状）； (3) 将菌液移到灭菌的1. 5mL的离心管中，lmL/管，8000rpm，离心5min，弃上清液； (4) 加入预冷的0.1MCaCl2 500yL/管，洗涤2次，悬浮，12000rpm，离心5min， 弃上清液； (5) 加入预冷的0.1MCaCl2 100yL，悬浮，30min后使用。
[0015] 6)转化 (1) 取10y1的连接产物加入到装有100y1感受态细胞的离心管中，轻轻转动以混匀 内容物，冰浴30min; (2) 将离心管放入42°C的水浴锅中热激90秒，快速转至冰浴中lOmin; (3) 加入500y1LB液体培养基，于37°C，170rpm震荡培养lh; (4) 取100mL涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯固体培养基(北京奥博星生物技术有限 公司）上，于室温下至涂布的菌液被培养基吸干，倒置培养皿，于37°C培养18~24h; (5) 挑取白斑。
[0016] 7)重组克隆的PCR鉴定 挑取PCR阳性菌落