检测马铃薯纺锤块茎类病毒real-time RT-PCR特异引物及探针和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子检测引物、检测探针及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 马铃薯是无性繁殖作物，由于病毒和类病毒侵染并通过块茎无性繁殖逐代增殖， 从而造成马铃薯的退化，严重影响了马铃薯的产量和品质。多数病原病害可以通过茎尖剥 离、组织培养来汰除。但是，马铃薯纺锤块莖类病毒病（Potatospindletuberviroid， PSTVd)是唯一不能/很难通过茎尖剥离、组织培养来汰除的，而到目前为止，还没有特效药 来防治，只能通过严格检测生产健康的种薯来汰除。因此，高效、快速、灵敏、易于推广的检 测技术对于防治PSTVd来讲尤为重要。
[0003] 目前，检测马铃薯类病毒主要有生物学检测、电子显微镜、往返电泳（R-PAGE)、 RT-PCR、NASH(核酸斑点杂交）和real-timeRT-PCR等方法，这些方法中，real-time RT-PCR是灵敏度最高的方法，该方法将PCR与荧光检测方法结合，以其特异性高和灵敏度 高（是普通RT-PCR的1000倍左右）、可定量及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物和 动植物疾病检疫方面得到广泛应用。但是，目前并没有采用该技术应用到PSTVd中，用以检 测PSTVd的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明首次将real-timeRT-PCR技术应用到检测PSTVd中，通过该方法建立的 PSTVdreal-timeRT-PCR检测体系大大提高了PSTVd检测的灵敏度，为PSTVd的防控工作 提供了技术保障。
[0005] 本发明的检测马铃薯纺锤块茎类病毒real-timeRT-PCR特异引物及探针，所述的 引物序列如序列表SeqIDNo:l所不和SeqIDNo:2所不，所述的探针序列如序列表Seq IDNo: 3 所示。
[0006] 本发明的马铃薯纺锤块茎类病毒real-timeRT-PCR检测方法，它是按照以下步骤 进行的：
[0007] 一、标准曲线的建立：
[0008] (1)提取待检测的马铃薯块茎和试管苗RNA，并反转录为cDNA，作为模板；
[0009] (2)采用步骤（1)的模板，进行PCR扩增，对PCR扩增后的目的片段进行回收，连接 至PMD18-T载体上，转化到感受态细胞内，提取质粒DNA，获得马铃薯纺锤块茎类病毒检测 用标准质粒；
[0010] (3)以获得的标准质粒为模板，利用权利要求1的real-timeRT-PCR特异引物及 探针，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，采用BioEdit软件绘制出实时荧光定量标准曲线；
[0011] 二、判定阳性或阴性的标准
[0012] 当扩增效率达到90%~110%，斜率为-3. 3,阴性对照不起峰时，根据标准曲线及 Cp值计算马铃薯纺锤块茎类病毒的含量，通过real-timeRT-PCR进行分析直接进行结果 判断。
[0013] 本发明的判定阳性或阴性的标准中根据标准曲线及Cp值准确计算PSTVd的含量， 该结果在仪器输出的检验报告中给出，可直接判读具体的拷贝数。每次检测标准曲线均需 重新扩增。
[0014] 本发明包含以下有益效果：
[0015] 本发明通过设计的引物和探针，成功建立了PSTVd的real-time RT-PCR检测体 系，该体系的建立丰富了我国PSTVd的检测技术，与灵敏度相对较高的RT-PCR技术相比，检 测灵敏度又提升了 100~1000倍。
[0016] 本发明根据马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd)基因序列，设计3对特异性引物和1 条探针，探针5'端采用FAM标记，3'端采用TAMRA标记。利用NY/T1962- 2010--《马 铃薯纺锤块茎类病毒检测》中规定的RT-PCR方法扩增目的片段，回收，转化，鉴定，并测序， 利用该目的片段与PMD18-T连接，制备了PSTVd与pMD18-T的重组质粒。利用该质粒采用 连续稀释法制备real-timeRT-PCR标准品。经筛选，从3对引物中筛选出1对最佳引物， 并据此建立了PSTVd的real-timeRT-PCR检测体系。该体系经稳定性测试，Cp值的变异系 数（CV)分别为 1. 64%、0. 61%、1. 80%、0. 47%、0. 92%、1. 11%、1. 45%和 0? 98%，表明检 测方法具有非常好的稳定性。该体系检测灵敏度达31c〇pieS/yL，用已知的22试管苗和休 眠块茎作为样品进行了验证试验，结果全部吻合。本发明建立的PSTVdreal-timeRT-PCR 检测体系大大提高了PSTVd检测的灵敏度，为PSTVd的防控工作提供了技术保障。
[0017] 本发明首次将real-time RT-PCR技术应用于PSTVd中，可以检测到PSTVd含量极 低的材料，对于珍贵的核心种苗等重要资源PSTVd的鉴定非常重要，可以把损失降低到最 小，极早发现问题，解决问题，确保脱毒种薯/苗的生产进程，保障种薯/苗的质量。另外， 该技术体系的建立对于PSTVd在寄主体内的复制及致病力研究等领域也有重要意义。
【附图说明】
[0018]图1为转化的菌落图；
[0019] 图2为未经转化的大肠杆菌感受态细胞直接涂布对照图；
[0020] 图3为阳性菌落PCR鉴定结果电泳图，其中，M为Marker，大小为100bp，1-18泳道 分别为转化的各菌落，大小为359bp;
[0021] 图4为以 PSTV231F，PSTV296R为引物的real-time PCR标准曲线；
[0022] 图5为以 PSTV234F，PSTV350R为引物的real-time PCR标准曲线；
[0023]图6为以 PSTV234F，PSTV356R为引物的real-time PCR标准曲线；
[0024] 图7为灵敏度测试图；
[0025] 图8为利用建立的real-time RT-PCR体系检测PSTVd的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0026] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
[0027]
【具体实施方式】一：本实施方式的检测马铃薯纺锤块茎类病毒real-time RT-PCR 特异引物及探针，所述的引物序列如序列表SeqIDNo:1所不和SeqIDNo:2所不，所述的 探针序列如序列表SeqIDNo:3所不。
【具体实施方式】 [0028] 二：本实施方式的马铃薯纺锤块茎类病毒real-timeRT-PCR检测 方法，它是按照以下步骤进行的：
[0029] 一、标准曲线的建立：
[0030](1)提取待检测的马铃薯块茎和试管苗RNA，并反转录为cDNA，作为模板；
[0031] (2)采用步骤⑴的模板，进行PCR扩增，对PCR扩增后的目的片段进行回收，连接 至PMD18-T载体上，转化到感受态细胞内，提取质粒DNA，获得马铃薯纺锤块茎类病毒检测 用标准质粒；
[0032] (3)以获得的标准质粒为模板，利用权利要求1的real-timeRT-PCR特异引物及 探针，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，采用BioEdit软件绘制出实时荧光定量标准曲线；
[0033] 二、判定阳性或阴性的标准
[0034] 当扩增效率达到90%~110%，斜率为-3. 3,阴性对照不起峰时，根据标准曲线及 Cp值计算马铃薯纺锤块茎类病毒的含量，通过real-timeRT-PCR进行分析直接进行结果 判断。
【具体实施方式】 [0035] 三：本实施方式与二不同的是：所述的实时PCR检测 仪为LightCycler480IIreal-timePCR仪。其它与二相同。
[0036]
【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】二不同的是：所述的PCR反应体系 如下：
[0037]
[0038]PCR反应程序为：95。(： 10min，l个循环，95。(： 10sec，55°C50sec，72°Clsec，45 个 循环。其它与【具体实施方式】二相同。
【具体实施方式】 [0039] 五：本实施方式与二不同的是：步骤一中所述的待检 测的马铃薯块茎和试管苗为PSTVd阳性马铃薯块茎和试管苗。其它与二相 同。
【具体实施方式】 [0040] 六：本实施方式与二不同的是：步骤一中进行PCR扩 增的引物为PSTVd0054R和PSTVd0055-3F;序列为：
[0041]PSTVd0054R:5, -GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3,；
[0042]PSTVd0055-3F:5' -CCGGGGAAACCTGGAGCGAACTGG-3'。其它与【具体实施方式】二相 同。
【具体实施方式】 [0043] 七：本实施方式与二不同的是：步骤一中对PCR扩增 后的目的片段进行回收是通过Tiangen公司的离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒对扩增产 物进行回收、纯化的。其它与二相同。
【具体实施方式】 [0044] 八：本实施方式与二不同的是：步骤一中连接反应体 系为 10yL，其中，pMD18-TVector为 0.8yL，PCR纯化产物为 4yL，ddH20为 1.2yL; SolutionI为5yL;反应条件为4°C条件下连接过夜。其它与二相同。
【具体实施方式】 [0045] 九：本实施方式与二不同的是：对马铃薯纺锤块茎类 病毒的real-timeRT-PCR检测方法进行灵敏度测试。其它与二相同。
[0046] 本实施方式对选出的Real-time RT-PCR体系进行灵敏度测试，方法为：利用浓 度较低的标准品制备标准曲线，经计算，