一种胶原蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白(Collagen)是由成纤维细胞(fibroblast)合成的一种生物性高分子物质，是哺乳动物体内含量丰富的蛋白质，约占人体或其他哺乳动物体内总蛋白质的20%?30 %。胶原蛋白主要分布于软骨、皮肤及肌腱等组织中，用以支持、保护及连接各组织器官的形态，已确认的胶原蛋白有20多种，其中I型胶原蛋白占全部胶原蛋白的90%以上。由于胶原蛋白具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，因此可以作为天然生物材料应用在生物医学领域中，例如，根据胶原蛋白的止血作用，可将其制作成海绵状的敷料贴类产品用于止血，也可以用来敷裹伤口 ；根据它的可降解性可以将其用作手术缝线，也可以将其作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。
[0003]目前，可以从动物的软骨、皮肤及肌腱等组织中提取胶原蛋白，例如，申请号为200810045400.9的专利提供了“从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法”，包括以下步骤:去除油脂和杂质并经丙酮浸泡预处理后的健康的猪、牛或羊的皮或/和腱原料肩，将所述原料肩经醋酸浸泡后加入胃蛋白酶进行酶解处理，制得酶解液；稀释所述酶解液并分离去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液；将胶原蛋白粗溶液进行盐析，得到盐析悬浊液；分离所述盐析悬浊液，将得到的胶原蛋白盐析物用蒸馏水搅拌透析；用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，即得到胶原蛋白。
[0004]现有技术中公开的“从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法”由于在对原料肩进行酶解处理时加入胃蛋白酶使得到的胶原蛋白中有胃蛋白酶等蛋白水解酶残由ο
【发明内容】
[0005]本发明的实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，用以获取具有胶原蛋白活性、无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留的纯度高的I型胶原蛋白。
[0006]为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案:
[0007]第一方面，本发明实施例提供了一种胶原蛋白的提取方法，包括:
[0008]对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；
[0009]将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；
[0010]将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。
[0011]在第一方面的第一种可能的实现方式中，所述抽提次数为两次，分别为第一次抽提和第二次抽提；其中，
[0012]所述第一次抽提包括:按照所述预处理后的原料与所述酸性溶液的体积比为1: (10-20)将所述预处理后的原料溶解于所述酸性溶液中，离心收集上清液一和原胶原蛋白沉淀二 ；
[0013]所述第二次抽提包括:将所述原胶原蛋白沉淀二溶解于与第一次抽提等量的酸性溶液中，离心收集上清液二 ；
[0014]将所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液。
[0015]在第一方面或第一方面的第一种可能的实现方式中，还提供了第一方面的第二种可能的实现方式，所述酸性溶液为体积浓度为0.5-5%的乙酸溶液。
[0016]在第一方面的第三种可能的实现方式，所述盐析纯化次数为三次，分别为第一次盐析，第二次盐析和第三次盐析；其中，
[0017]所述第一次盐析包括:向所述抽提混合液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为4-6%，静置，离心收集胶原沉淀一；
[0018]按照胶原沉淀一与缓冲液的体积比为1:20-1:30将所述胶原沉淀一溶解于所述缓冲液中，获取原胶原蛋白溶液；
[0019]所述第二次盐析包括:向所述原胶原蛋白溶液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为1.5-1.8mol/L，静置，离心收集上清液；
[0020]所述第三次盐析包括:向所述上清液中加入无机盐至所述无机盐溶液的质量浓度为2.0-3.0mol/L，静置，离心收集所述上清液的沉淀，得到所述胶原蛋白盐析沉淀。
[0021]在第一方面或第一方面的第三种可能实现方式，还提供第一方面的第四种可能实现方式，其中，所述静置的时间为18_30h，静置所处的温度为2-6°C。
[0022]在第一方面或第一方面的第三种可能实现方式，还提供第一方面的第五种可能实现方式，所述无机盐为氯化钠。
[0023]在第一方面的第六种可能实现方式，所述将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白，包括:
[0024]将所述胶原蛋白盐析沉淀溶解于酸性溶液中，获取胶原蛋白溶液；
[0025]将所述胶原蛋白溶液经过超滤系统等倍透析，去除所述胶原蛋白溶液中的杂质及小分子胶原蛋白；
[0026]将所述去除杂质及小分子胶原蛋白的胶原蛋白溶液冻干，得到所述胶原蛋白。
[0027]在第一方面及第一方面的第六种可能方式中，还提供第一方面的第七种可能实现方式，所述酸性溶液的体积浓度为0.3-1.0%，所述酸性溶液为乙酸溶液。
[0028]在第一方面的第八种可能实现方式中，所述原料为猪、牛或羊的皮或/和腱，在所述对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液之前，所述方法还包括:
[0029]将猪、牛或羊的皮或/和腱清洗灭菌剔除外表皮皮毛和皮下组织后，绞切成颗粒；
[0030]向所述颗粒中加入中性清洗溶液，离心清洗2-5次，收集沉淀，获得所述预处理后的原料。
[0031]在第一方面和第一方面的第八种可能实现方式中，所述中性清洗液的重量为所述预处理后的原料的重量的2-3倍。
[0032]本发明实施例提供一种胶原蛋白的提取方法，对预处理后的原料利用酸性溶液进行至少一次抽提，获取抽提混合液；将获取的所述抽提混合液进行至少两次盐析纯化，获取胶原蛋白盐析沉淀；将所述胶原蛋白盐析沉淀透析、冻干，得到所述胶原蛋白。在对预处理后的原料利用酸性溶液进行抽提能够保证预处理后的原料中的胶原蛋白的产率，对抽提混合液采用至少两次盐析纯提取出的胶原蛋白为具有胶原蛋白活性的高纯度I型胶原蛋白，且由于本发明采用抽提而非酶解处理预处理后的原料，故所获得的胶原蛋白中无胃蛋白酶等蛋白水解酶残留，采用透析，去除了胶原蛋白中杂质及非I型胶原蛋白蛋白质，最终所得胶原蛋白的纯度不低于95%，采用本发明实施例的胶原蛋白提取方法提取的胶原蛋白由于其具有良好的生物相容性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，可作为天然生物材料用于生物医学领域。更重要的是可以作为支架材料用于组织工程医学领域，引导组织再生，促进伤口修复愈合。
【附图说明】
[0033]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0034]图1为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图一；
[0035]图2为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图二 ；
[0036]图3为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图三；
[0037]图4为本发明实施例提供的一种胶原蛋白的提取方法的流程示意图四。
【具体实施方式】
[0038]现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限定本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以