一种聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细胞载体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞载体及其制备方法领域，特别涉及一种聚（癸二酰基甘油二酯） 在制备视网膜神经细胞载体中的应用。
【背景技术】
[0002] 老年性黄斑变性（AMD)和色素性视网膜炎（RP)是造成视神经元退化变性进而导 致视力缺陷的两个主要因素。新发展的治疗手段可将病变的视网膜神经元重建。由此发展 出多种治疗方法，比如基因治疗、生长因子治疗和小分子药物疗法。但这些治疗方法只能延 缓病变恶化，不能从根本上治疗疾病。近年来，数据显示体外培养视网膜神经细胞元移植到 体内替换病变组织的治疗方法得到越来越多的关注。但寻找一种合适的细胞培养基质作为 细胞的递送载体成为这一治疗方法突破的关键。聚（癸二酰基甘油二酯）[Poly (sebacoyl diglyceride)，PSeD]是新近研制的功能化可降解聚酯，其在生物医学领域展现出了良好的 应用前景。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细 胞载体中的应用，该发明中的视网膜神经细胞递送载体，具有良好的生物相容性，细胞的炎 症表达和细胞凋亡因子低，而且具有优异的促神经分化功能。
[0004] 本发明的聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细胞载体中的应用，视网膜 祖细胞RPCs在视网膜神经细胞载体上进行增殖、分化和迀移；其中，视网膜神经细胞载体 的成分包括聚（癸二酰基甘油二酯）PSeD。
[0005] 所述PSeD的分子式为
[0006] 所述PSeD的分子式中n = 10-300。
[0007] 所述PSeD的制备方法包括：将二缩水甘油癸二酸值单体、等摩尔量的癸二酸和催 化量的四丁基溴化铵溶解在DMF中，在氮气保护下的干燥的反应管中150°C反应24小时，沉 淀纯化，真空干燥，即得。
[0008] 本发明通过RPCs的分离和培养、PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用、免疫细胞 化学、蛋白质印迹分析、总RNA分离及质量控制、逆转录和定量聚合酶链反应（qPCR)、细胞 毒性分析、创伤愈合和统计分析来表征PSeD对RPCs行为的影响。
[0009] 有益效果
[0010] 本发明的视网膜神经细胞递送载体，具有良好的生物相容性，细胞的炎症表达和 细胞凋亡因子低，而且具有优异的促神经分化功能，具有很大的应用前景。
【附图说明】
[0011] 图1为实施例1中PSeD对RPCs的细胞毒性的表征；A :在增殖条件下，炎症因子 (MCP-1)的表达和细胞在支架上的生长通过qPCR分析；B :RPCs在PSeD和PLGA支架以及对 照组上培养细胞的凋亡因子（Caspase-3)表达；C:增殖条件下培养三天，测量RPC细胞粘 附因子cadherin 4的表达；D :RPC细胞在PSeD和PLGA支架上培养对于通过乳酸脱氢酶释 放试验（LDH assays)与对照组的比较；
[0012] 图2为实施例1中PSeD对RPCs的分化影响；A为在分化条件下，RPCs在PSeD上 的生长情况；B-D为qPCR分析；E-J为蛋白质印迹分析；a中比例尺：100 ym ;b中比例尺： 50 u m ；
[0013] 图3为实施例1中利用免疫染色分析对PSeD对RPC分化的影响；其中，生 长在P S e D上RP C s中含视觉神经细胞和神经胶质细胞的标志物包括：0 3-管蛋白 (A-D)，rhodopsin (E-H)，GFAP (I-L);比例尺为 100 y m;
[0014] 图4为实施例1中创口愈合实验的效果数据；其中，A为创口愈合图；B为创口愈 合程度数据；C为细胞的迀移速度；比例尺为200 y m。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0016] 实施例1
[0017] PSeD 的合成。
[0018] 二缩水甘油癸二酸酯单体、等摩尔量的癸二酸和催化量的四丁基溴化铵 (TCI，>99. 0% )溶解在DMF中，在氮气保护的干燥的反应管中加热（150°C )反应24小时。 然后反应液用乙醚沉淀纯化三次，然后将沉淀物抽真空干燥获得PSeD。
[0019] 通过RPCs的分离和培养、PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用、免疫细胞化学、 蛋白质印迹分析、总RNA分离及质量控制、逆转录和定量聚合酶链反应（qPCR)、细胞毒性分 析、创伤愈合和统计分析来表征PSeD对RPCs行为的影响。
[0020] 实施例中的NC表示无材料空白试验组。
[0021] (l)RPCs的分离和培养
[0022] 本发明所用动物均依照视觉与眼科协会动物使用标准，并严格按照Schepens眼 科研究所动物饲养使用委员会审批过的程序进行。视网膜神经祖细胞从出生1天的绿色荧 光蛋白呈阳性（GFP+)的转基因C57BL/6小鼠身上获得，合并视网膜经过切碎及几个周期 0. 1 %的I型胶原蛋白酶消化进行分离。分离的RPCs用孔径为100微米的尼龙网进行过滤， 在转速为800rpm下离心4min，将细胞在含有DMEM/F12 (Invitrogen)，1 % N2神经供给物 (Invitrogen)，2mML_ 谷氨酰胺（Invitrogen)，100U/ml 青霉素-链霉素（Invitrogen)，and 20ng/ml表皮生长因子（EGF，Invitr〇gen)的培养液中进行培养。将细胞种植在培养皿中 并每隔3-4天传代一次。为了对细胞的分化情况进行分析，将增殖培养液用分化培养液替 代，将其中表皮生长因子（EGF)除去，并加入10%的胎牛血清（Invitrogen)。用于细胞培养 的聚合物样品涂膜于聚苯乙稀组织培养板（Tissue culture-treated polystyrene, TCPS) 上。将浓度为lg/1的PSeD和PLGA(作为对照）的甲醇溶液分别加入到12孔聚苯乙烯组 织培养板（tissue culture-treated polystyrene, TCPS)中（80 yl/孔）。待甲醇挥发后， 置于真空中抽吸12小时进一步去除溶剂获得涂膜的组织培养板。将组织培养板置于紫外 光下30min进行杀毒，然后用lml磷酸盐缓冲液清洗三次，再用lml培养液润洗，接着种上 RPCs，进行培养。
[0023] (2) PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用
[0024] RPCs在PSeD/PLGA的生长情况分别在培养第1，3，5天时用标准落射荧光显微 镜（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)进行拍照观察，其增殖情况通过CCK-8试剂盒 (cell counting kit-8, Do jindo, Kumamoto, Japan)进行进一步检测。细胞培养在 96 孔板， 浓度为1 X 104个细胞/孔，CCK8溶液在第一天，第二天，第三天直接加入孔板中，在37°C继 续培养4h后，用ELISA读板器（ELX800, BioTeK，USA)测量其在450nm处的吸光度，细胞活 性用A450值进行表示。为了表征在分化条件下，生长在PSeD上的RPCs细胞形态，在第三 天的时候用标准落射焚光显微镜（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)放大10倍和20 倍进行拍摄。
[0025] (3)免疫细胞化学
[0026] RPCs在培养三天后（增殖条件下）或者七天后（分化条件下），RPC-PSeD，RPC-PLGA和RPC-glass复合物用磷酸缓冲液（PBS)润洗三次然后室温下用多聚甲 醛（Invitrogen)固定15分钟。磷酸缓冲液润洗三次后，细胞固定在固定液（磷酸缓冲 液包括10%常规羊血清（111￥；[1：1'(^611)，0.3%1'1'；[1:011父-100(31区1]13-八1(11'；[(311)和0.1% NaN3(Sigma-Aldrich))中1小时。4°C下与初级抗体培育过夜，然后细胞与二级抗体继 续培育（Alexa Fluor546_goat anti-mouse/rabbit，BD，l:800)，继续水洗。细胞核用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI ;Invitr0gen)染色。免疫细胞利用荧光显微镜（Olympus BX51，Japan)观察，拍照。免疫活性细胞比例根据划分由DAPI染色的细胞核数目确定。每组 随机划取区域分别观测到共500至1000细胞。数据收集使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD)0
[0027] 5_ 漠 _2_ 脱氧尿昔（BrdU)惨杂：在 10yM BrdU (Sigma-Aldrich, Poole, UK)存在 条件下培养8小时，室温下用4%的多聚甲醛处理样品15分钟然后用封闭缓冲液（PBS含 有 10% 的 NGS，0. 3% riton X-100,和 100 y g/ml RNaseA)培育 60 分钟。细胞随后用 PBS 润洗，室温下用2M HC1培育30分钟，然后先用PBS再用汉克斯平衡盐溶液（HBSS)室温 下润洗。4°C下利用抗 BrdU 抗体在培育过夜（1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA，USA)，细胞用PBS润洗，和荧光共辄二级抗体（Alexa Fluor488-goat anti-mouse，1:800)室温下培育1小时。细胞核利用DAPI染色。免疫活性细胞利用荧光显 微镜（Olympus BX51, Japan)观察，拍照。
[0028] (4)蛋白质印迹分析
[0029]使用 RIPA(Radioimmunopr