3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及 其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物萜类的生物合成途径有两条：甲戊二羟酸途径甲戊二羟酸途径（mevalonic pathway，MVA)和脱氧木糖磷酸酯途径（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP) 〇 MVA途径位于细胞质和内质网中，萜类化合物主要是以MVA途径在细胞质中合成。3-羟 基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reductase，HMGR)催 化HMG-CoA形成甲轻戊酸（mevalonate，MVA)，MVA的生成是一个不可逆的过程，所以3-轻 基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶被认为是MVA途径中的限速酶。
[0003] 萜类化合物广泛存在于高等动、植物及真核生物体内。它是由三十个碳结合成六 角形或五角形的天然有机化合物的总称。其在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均有重要 作用。研究发现，三萜类化合物具有多种生物活性，包括调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、 抗炎症、抗氧化等。
[0004] 药理研究表明，三萜类化合物是极具开发潜力的天然资源，如从红豆杉中发现的 紫杉醇可用于肿瘤的治疗，来自于黄花蒿的青蒿素是治疗疟疾的特效药，丹参酮对心血管 系统疾病有良好的疗效并被制成多个剂型供临床使用，大戟属植物中的松香烷内酯型成分 具有抗炎抗肿瘤和致炎致癌的双重生理活性等。
[0005] 目前，随着应用范围的不断扩大，三萜类化合物需求量急剧上升；但植物中三萜类 化合物含量较低，化学合成虽然条件成熟，但由此产生的活性成分含量和质量极不稳定。现 代生物工程与生物技术的发展，使得多种三萜类化合物合成途径中的关键酶基因被克隆、 分离、鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产三萜类化合物提供了新途径。
[0006] 灰树花是食、药兼用蕈菌，其属于非褶菌目、多孔菌科、树花属，含有多种功能性成 分，如多糖、萜类、氨基酸等，具有良好的防癌抗癌、抗衰老、抗病毒等功能，目前，以拟南芥、 烟草、辣椒、穿心莲、人参、铁皮石斛、灵芝中已克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原 酶基因，但未见以灰树花为材料克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用，该 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶可显著提高植物三萜类化合物的合成量。
[0008] -种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示。
[0009] 本发明还提供了一种编码所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因。
[0010] 优选地，所述基因的碱基序列如SEQ ID N0. 5所示。
[0011] 本发明还提供了一种包含所述的基因的表达盒。
[0012] 本发明又提供了一种包含所述的基因的重组载体。所述的重组载体的原始载体为 pGEM-T 或 pCAMBIA1302。
[0013] 本发明还提供了一种包含所述的基因的转化子。宿主为大肠杆菌细胞、农杆菌细 胞或樟芝菌丝体细胞。
[0014] 本发明还提供了一种所述的转化子在生产三萜类化合物中的应用。作为优选，所 述三萜类化合物为樟芝三萜。
[0015] 本发明所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因可提高植物中三萜的合 成量，提高植物的抗病性和抗逆性，可应用于植物基因工程，制备转基因植物品种、转基因 食用真菌品种，如：转基因水稻、拟南芥、人参、灵芝等植物和食用真菌。
[0016] 本发明通过提取灰树花子实体的总RNA，逆转录后构建cDNA文库，二代测序数据 分析发现了一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，通过RT-PCR技术克隆了灰树花的 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（Gfhg)，得到了 3669bp的完整基因序列；构建了 真核表达载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg转化樟芝菌丝体表达系统，对克隆的Gfhg基因功能 进行了验证，Gfhg基因能够在樟芝菌丝体中正常表达，产生樟芝三萜及其衍生物。灰树花 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（Gfhg)能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量 以及下游次级代谢产物，使植物产生或提高三萜的含量、提高植物的抗病性。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明pGEM-T-Gfhg载体的示意图；
[0018] 图2为本发明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg载体的示意图；
[0019] 图3为本发明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg载体的酶切结果；
[0020] 左为 DNA ladder (碧云天，D0107)，右为 pCAMBIA1302-Gfhg-hyg 载体酶切结果；
[0021] 图4为本发明转基因樟芝子实体阳性克隆的PCR检测结果；
[0022] M为DNA Marker III (TIANGEN)，1-7为转基因樟芝子实体阳性克隆，CK为未转基 因对照；
[0023] 图5为本发明樟芝菌丝体对照及转基因克隆中、其他物种中3-羟基-3-甲基戊二 酰辅酶A还原酶活性检测结果；
[0024] 从左至右分别为未转基因对照、转基因樟芝菌丝体、灵芝、烟草、人参、拟南芥中 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性测定结果。
[0025] 图6为本发明樟芝菌丝体对照及转基因克隆中樟芝三萜的含量检测结果；
[0026]CK 1、CK2为未转基因对照中樟芝三萜的含量，1、2、4、5、6、7为转基因PCR阳性克隆 中樟芝三萜的含量。
【具体实施方式】
[0027] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得 到。
[0028] 实施例1灰树花总RNA的抽提
[0029] 抽提步骤如下：
[0030] (1)样品的裂解：取灰树花子实体50~100mg置于研钵中，加入液氮快速研成粉 末，移入已经加入lml Trizol的离心管中，用移液器吹打混匀；
[0031] (2)室温静置 5min，4°C，12000rpm 离心 lOmin ;
[0032] (3)将上清液移入另一离心管中，加入200 yL氯仿，颠倒混匀，室温放置lOmin， 4°C，12000rpm 离心 15min ;
[0033] (4)转移上层水相，将其移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 5 ~lOmin ;
[0034](5) 4°C，12000rpm离心 lOmin，弃上清；
[0035](6)加入500 y L的75%乙醇，混勾片刻后，4°C，7500rpm，离心5min，小心弃上清；
[0036] (7)室温静置lOmin左右，干燥RNA沉淀，加入适量无RNase的水溶解，电泳检测 RNA质量。
[0037] 实施例2灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（Gfhg)的克隆
[0038]取 1 y g总 RNA，以random hexamers为引物，按照 Superscript III First-Strand Synthesis System说明操作，反转录生成第一链。
[0039] 根据灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因⑶S序列设计引物如下：
[0040]上游引物 SEQ ID NO. lGfhg-F :ga aga tct atg cgt gcg ata ctt cgc ccg c ; [0041]下游引物 SEQ ID NO. 2Gfhg_R :cc cac gtg tea ctt cgt etc cac age ata gc ;
[0042] 取灰树花总RNA反转录生成的第一链cDNA为模板做PCR扩增。
[0043] PCR反应体系如下：
[0044]
[0045] PCR扩增程序如下：
[0046]
[0047] 参考Quick Gel Extraction Kit (康为世纪）说明书对扩增产物进行切胶回收。
[0048] 实施例3克隆载体pGEM-T-Gfhg的构建
[0049]参考 pGEM-T Vector Systems (Promega)，米用试剂盒中的 T4 DNA Ligase 将切胶 回收的Gfhg基因片段（SEQ ID NO. 5)与T载体连接起来。
[0050] 参考pGEM-T Vector Systems (Promega)说明书，将连接产物转入DH5 a大肠杆菌 感受态细胞。在转化产物中加入400 y L LB液体培养基，37°C，200rpm摇床培养2h后，均匀 涂布于含X-Gal，IPTG，AMP的LB固体培养皿上，正置lh晾干，37°C倒置培养28-24h形成单 菌落。
[0051] 以上述引物Gfhg-F和Gfhg-R对10个单克隆进行PCR鉴定，PCR条件：93°C，3min ; 93°C，30s ;56°C，30s ;72°C，3min，30 个循环；72°C，10min。PCR 产物电泳验证，选择电泳条 带正确的克隆送上海生工测序，测序结果与灰树花二代转录组测序组装数据库进行比对， 克隆载体图谱见图1。
[0052] 实施例4真菌表达载体pCAMBIA1302-Gfhg_hyg的构建
[0053] 将克隆载体pGEM-T-Gfhg和pCAMBIA1302真菌表达空载体，用Bgl II，Pml I (Promega)分别酶切，真核表达载体图谱见图2。
[0054] 其反应体系为：
[0055]
[0056] 37°C 温浴 3h。
[0057] 1%琼脂糖凝胶电泳检测条带后，参考琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Invitrogen) 说明书对Gfhg片段和pCAMBIA1302真菌表达空载体进行回收，参考T4连接酶反应试剂 盒说明书（takara)对回收产物进行连接，连接产物转化Ecoli DH5a，涂布于含卡那霉素 50mg/mL的LB平板。挑选单克隆，于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，37°C，200rpm振 荡培养过夜。将菌液倒入1. 5mL的EP管中，12000rpm离心lmin，收集菌体，用于质粒抽提， 参考柱式质粒小量提取试剂盒（Invitrogen)说明书抽提质粒。以质粒为模板，以Gfhg基 因上下游引物Gf-F和Gf-R进行PCR反应，以检验表达载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg是否构 建成功。
[0058] PCR反应体系如下：
[0059]
[0060] PCR扩增程序如下：
[0061]
[0062] PCR产物进行