一种脱落细胞dna低频突变富集测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物信息学高通量测序技术领域，具体涉及一种脱落细胞DNA低频突 变富集测序方法。
【背景技术】
[0002] 脱落细胞是指自然管腔器官内表面粘膜正常情况下，人体器官粘膜上皮细胞经常 有脱落更新，一般分为3大类：鼻咽部、口腔、食肠管、阴道等的自然脱落细胞以及部分人工 刷洗所得细胞；体腔抽出液（胸腔积液，脑脊液，心包腔积液等）；针吸细胞。由于其具有安 全性，设备操作简便性，以及基于其组织病理特性，逐渐发展出一门新兴学科，脱落细胞病 理学，广泛应用于相关肿瘤早筛检测诊断中。但传统检测存在一定的误诊率，约有10-40% 假阴性，主要原因一方面是由于细胞学检查局限性，只看单个或一小堆细胞，不能全面观察 病变组织结构。另一方面脱落细胞学诊断难度较大，需要有经验的医生复验。遇到可疑或 无把握病例应重复取材，需仔细观察。此外整体的传统临床检测诊断过程依然费时，费力， 急需要一种更高精准实用性的检测手段。
[0003] 目前随着分子生物学以及测序技术的飞速发展，基于高通量测序技术的脱落细胞 检测正逐步走入临床，尤其是基于宫颈脱落细胞的HPV分型的高通量测序技术以其简便， 快速，高通量，高准确性等特点，正逐步取代传统的宫颈巴氏涂片法，但是目前常规测序技 术本身存在有一定的错误率，且由于个体差异，肿瘤发生发展时期，取材操作等原因，脱落 细胞中的肿瘤细胞丰度往往存在很大波动，甚至〇. 1 %左右的低丰度水平，从而导致基于常 规测序技术仍然存在一定的假阴性以及假阳性。因此亟需一种准确率高、操作简便的测序 技术用于脱落细胞DNA的检测，为疾病的早期筛查提供可信赖的检测手段。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法以克服现有技术的不足。
[0005] 本发明提供的一种脱落细胞DNA低频突变富集测序方法，包括以下步骤：
[0006] (1)脱落细胞的DNA提取与打断；
[0007] (2)打断后的脱落细胞DNA文库构建；
[0008] (3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集；
[0009] (4)探针富集捕获、杂交捕获产物的扩增与上机测序；
[0010] (5)正反双链纠错低频信息分析。
[0011] 本发明方法的流程图见图1。
[0012] 其中，步骤（1)所述的脱落细胞来自人类，步骤（2)的文库构建方法按照3步酶促 反应，即末端修复，加"A"和文库接头连接。
[0013] 文库接头使用的引物为：
[0014] 接头第一链：TACACTCTITCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，
[0015] 接头第二链：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
[0016] 本发明方法中，步骤（3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集包括以下步骤：
[0017] 1)确定文库的Tm值；
[0018] 2)绕过每个插入片段存在的特异Tc值，基于1对通用引物，在1个系列的循环条 件下，对文库中所有片段上的各种突变类型进行富集；设定Tc min~TM-2. 5,之后Tc以 0.5°C逐步递增，在每个Tc条件下分别进行FULL COLD PCR;所述插入片段是指文库中与接 头连接的DNA片段。
[0019] 进一步地，文库Tm值通过以下方法来确定，对正常人脱落细胞DNA的文库采用一 对引物使用荧光定量PCR，根据溶解曲线分析获得文库Tm值；所述引物的序列为：
[0020] 上游引物：
[0021] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，
[0022] 下游引物：
[0023] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其 中 xxxxxxxx 为 index 标签。
[0024] 上述步骤2)中，所述1对通用引物为通用文库TT-COLDPCR引物，其核苷酸序列 为：
[0025] 上游引物：
[0026] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，
[0027] 下游引物：
[0028] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其 中 xxxxxxxx 为 index 标签。
[0029] 上述步骤2)中，所述1个系列循环条件为：
[0030]
[0031]
[0032] 本发明方法中，步骤（4)所述探针富集捕获是将扩增后的文库质控合格后，采用 富集探针芯片进行杂交捕获，并对杂交捕获产物进行PCR扩增，然后进行上机测序；
[0033] 富集探针芯片的设计方法为：基于目的基因的用途确定芯片捕获区间，参考目标 DNA所属的数据库，在一定碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点，同时针对该 位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作为其在该位 点总探针覆盖水平所占的比例；针对热点变异，将基于人基因组参考序列hgl9设计的探针 替换为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，同时热点变异探针总覆盖度与其他 区域正常探针覆盖度的差异比例不少于3 :1，从而实现捕获时对热点变异的富集。
[0034] 本发明方法中，步骤（5)正反双链纠错低频信息分析（RealSeq Pipeline)具体方 法为：
[0035] 1)基于测序结果，截取成对测序序列中的测序序列一的前12bp碱基和测序序列 二的前12bp碱基作为标签，且根据字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引， 同时根据标签的排列组合方式，选定正链和反链
[0036] 2)对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序重复测序序列聚集 到一起的目的；
[0037] 3)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明 距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的 汉明距离不超过10,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
[0038] 4)对步骤3)中获得的同一个DNA模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序 列数都达到2对以上，则进行后续分析；
[0039] 5)对满足4)中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列.对于DNA模板 的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80%，且在反链测序 序列中的一致率也达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便 得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列；
[0040] 6)将新测序序列用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测 序序列；
[0041] 7)根据6)中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布， 统计目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率；
[0042] 8)Call SNV/InDel/SV/CNV :根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect流 程 call somatic SNV 变异；用 gatk 流程 call somatic InDel 变异；用 contra, py 流程 call CNV ;用 somVar 流程 call SV ;
[0043] 所使用的筛选参数为：对照位点变异率< 2% ;纠错后变异测序序列条数多2 ;突 变预测P值< 〇. 05 ;
[0044] 9)变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已 有变异数据库中的该变异的情况。
[0045] 进一步地，上述步骤1)中，基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片 段是文库中与接头引物相连接的DNA片段，经双末端测序，每个片段将形成一对成对测序 序列；将成对测序序列的测序序列1的如12bp喊基和测序序列2的如12bp喊基作为标签， 字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列 的索引，测序序列1的标签在前就标记成正链；测序序列2的标签在前就标记为反链。
[0046] 本发明提供了 一种脱落细胞DNA低频突变富集测序试剂盒，其含有富集探针芯 片，所述芯片上探针是将基于人基因组参考序列hgl9设计的探针替换为基于突变碱基设 计的探针，其他位点探针不变，且热点变异探针总覆盖度与其他区域正常探针覆盖度的差 异至少为3:1 ;
[0047] 基于目标DNA突变碱基设计探针的原则为：基于目的基因的用途确定芯片捕获区 间，参考目标DNA所属的数据库，在一定碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点， 同时针对该位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作 为其在该位点总探针覆盖水平所占的比例。
[0048] 本发明提供了一种脱落细胞DNA低频突变富集测序系统，包括以下操作单元：
[0049] (1)脱落细胞DNA提取与DNA打断单元；
[0050] ⑵脱落细胞DNA文库构建单元；
[0051] (3)通用文库TT-COLD PCR扩增富集单元；
[0052](4)探针富集捕获单元、杂交捕获产物的扩增与上机测序单元；
[0053] (5)正反双链纠错低频信息分析单元。
[0054] 其中，操作单元（1)血浆ctDNA的提取与文库构建具体操作为：抽取早期患者外周 血5-10mL，常温或4°C存于EDTA抗凝管中，在4-6小时内对外周血进行分离，得到血浆和白 细胞，白细胞提取的DN