锰超氧化物歧化酶sod2的体外分子检测方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，主要应用于生物体外实验，和临床体外诊断，尤其是 一种锰超氧化物歧化酶S0D2的体外分子检测方法及引物。 技术背景
[0002] S0D是Super Oxide Dismutase缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要 的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。S0D具有特殊的生理活性， 是生物体内清除自由基的首要物质。S0D在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观 指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞 造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力， 环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成。
[0003] S0D常用于对缺血、出血性心、脑等重要脏器病伤（或手术治疗后）引发的继发性 (自由基）过氧化损伤及其自由基清除药物治疗效果的监测，以指导临床制定相应的自由 基清除干预对策及最佳治疗时间窗的确立，它对自由基继发损伤病情的诊断、自由基清除 治疗疗效跟踪和预后判断与评估等具有重要参考价值。比较一致的意见是：S0D测定虽然 是一种非特异的辅助诊断指标，但对机体自由基代谢紊乱、自由基清除干预对策、以及对于 同一病患者病程转归（自由基损伤的加剧或降低、自由基清除剂药物或手术治疗效果）的 判断，实时动态监测具有重要参考价值。
[0004] S0D2是S0D家族的一种，目前目前体外的S0D的检测方法主要集中在蛋白质与蛋 白质互作的elisa法和酶竞争法，此方法可以检测酶的活性，但是由于样品蛋白质认为操 作因素导致误差大，且蛋白质不稳定，极易降解和变性，导致活性下降和失活。结果的可信 度大打折扣。且检测是检测所有的S0D，无法具体区分S0D2中的具体含量。
[0005] 目前市场还尚未发现有关分子检测S0D2的试剂盒，此发明对未来S0D2更加精确 应用到临床等领域提供了强有力的分子检测基础。
[0006] CN102095856A公开了一种超氧化物歧化酶快速检测卡及其检测方法，在长条扁平 薄壳状的检测卡外壳中设置测试条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；测试条是由支 承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成； 支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样 品垫，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜 的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜；胶体金膜为含抗超氧化物歧化酶抗体胶体金 标记的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是：含超氧化物歧化 酶的检测带，含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样 孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
[0007] 目前市场还尚未发现有关S0D2的分子水平检测试剂盒，本发明对未来分子检测 S0D提供了强有力的基础。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种人体内锌铜超氧化物歧化 酶S0D2表达量的体外分子检测方法及所用的引物，本方法可以在体外检测人体不同组织、 细胞受到的氧化损伤程度的相对大小，可应用于体外基因分子诊断等方面。
[0009] 本法实现目的的技术方案如下：
[0010] -种锰超氧化物歧化酶S0D2的体外分子检测引物，正向引物序列见序列1，反向 引物序列见序列2。
[0011] 与锰超氧化物歧化酶S0D2的体外分子检测引物配合使用的内参引物，正向引物 序列见序列3,反向引物序列见序列4。
[0012] -种锰超氧化物歧化酶S0D2的体外分子检测方法，步骤如下
[0013] ⑴目标组织或细胞中总RNA的提取：
[0014] ⑵采用步骤⑴提取出的RNA进行逆转录PCR，获得模板RNA ;
[0015] ⑶采用锰超氧化物歧化酶S0D2的体外分子检测引物，正向引物序列见序列1，反 向引物序列见序列2,以及步骤⑵的模板RNA进行实时荧光定量PCR。
[0016] 本发明的优点和积极效果：
[0017] 本发明开发一种以荧光定量PCR检测为主的相对定量检测试剂盒，也可以稳定、 特异、准确的检测出人的不同组织、细胞中S0D2基因的表达量差异，且有极高的重复性。克 服了市场上常用酶活检测试剂盒的人为因素影响大、稳定性差、重复性差等因素。在医疗检 测和化妆品抗衰老领域，配合大量临床实验数据的基础上，可以早期判断由于S0D2酶表达 量高低反映相关疾病的情况，对疾病的早期治疗和预防起到积极的作用。目前市场上还未 出现关于S0D2的检测产品，尤其是分子生物学检测的方法，有利于推动S0D分子检测市场 的发展。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明GAPDH、S0D2扩增基因琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图2为本发明引物特异性；
[0020] 图3为本发明qPCR反应性灵敏性；
[0021] 图4为本发明结果分析5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后的S0D2表达量差 异柱状图；
[0022] 图5标准曲线。横坐标为拷贝数lg值，众坐标为Cq值。
[0023] 具体的实施方式
[0024] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0025] 本方法中荧光定量PCR引物的设计，首先，根据RNA序列号：NM_001024465. 1正反 向引物均是跨基因组内含子设计，避免了由于样品中残留的基因组DNA的污染，而导致结 果的准确度低和重复性差的缺点，提高了特异性和结果的准确度。其次，使用NCBIblast比 较，与使用PRMER5. 0设计软件分析，优化引物，将发各项指征均控制在最优范围之内，极 大程度降低了引物二聚体的形成。将引物长度达到较高的25bp，在一定程度上也提高了扩 增的特异性。无需加入DNase处理，同时采用sybergreen法，同探针法相比节省了一定的 成本。
[0026] 具体实验过程如下：
[0027] -、以人皮肤细胞（HSF)体外培养，给5种不同浓度的双氧水处理为例；
[0028] 1、将HSF细胞铺于2个六孔板的10个孔之中，每孔数量控制在80000,每孔含1ml 的高糖DMEM培养基，含10%的胎牛血清，放置于C02培养箱37°C培养24h使其正常贴壁。
[0029]