10h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
(2)按料液比1:25的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度30°C、pH8条件下，搅拌混合40min后，于8000rpm离心25 min,收集上清液，上清液用0.lmol/L HCL和0.1mol/L NaOH调节pH值5以沉淀蛋白，再8000rpm离心20min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将PH节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
(3 )称取辣椒籽粗蛋白制备质量百分比5%的辣椒籽粗蛋白水溶液，50°C下调节pH7.5，添加胰蛋白酶，酶活为5000U/g辣椒籽粗蛋白，酶解3h后将酶解液100°C煮沸5min灭酶，9000 rpm离心25min取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
(4)将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配置成30mg/ml的水溶液，37°C下与1.0 X 105CFU/ml金黄色葡萄球菌菌悬液轻微振荡(50 rpm/min)孵育40min，经0.22微米微孔滤膜过滤去除菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱(16mmX 100cm，流速0.8ml/min,去离子水洗脱)检测与金黄色葡萄球菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与金黄色葡萄球菌菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
[0015](5)辣椒籽抗菌肽抑菌率分析时将100微升经0.22微米微孔滤膜过滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入96孔酶标板中，再加入等体积的1.0 X 15 CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液作为试验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的辣椒籽抗菌肽溶液作为对照组，37°C培养12 h后用酶标仪测定620nm下吸光值，辣椒籽抗菌肽抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的比值。经抑菌率检测，本发明方法所获得辣椒籽抗菌肽对宋内志贺氏菌的抑菌率为74.16%。
[0016]实施例3:以大肠杆菌筛选制备辣椒籽抗菌肽的方法，具体内容为:
(I)将辣椒籽粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比1:10，50W超声处理60min后，于80°C浸提2h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:5的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，55W超声处理50min，30°C下150 rpm/min搅拌浸提8h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
(2)按料液比1:30的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度40°C、pH9条件下，搅拌混合30min后，于5000rpm离心15 min,收集上清液，上清液用0.lmol/L HCL和0.1mol/L NaOH调节pH值5以沉淀蛋白，再6000rpm离心15min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将PH节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
(3)称取辣椒籽粗蛋白制备质量百分比6%的辣椒籽粗蛋白水溶液，60°C下调节pH9，添加碱性蛋白酶酶，酶活为4000U/g辣椒籽粗蛋白，酶解3h后将酶解液100°C煮沸8min灭酶，8000 rpm离心20min取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
(4)将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配置成40mg/ml的水溶液，37°C下与1.0 X 105CFU/ml大肠杆菌菌悬液轻微振荡(50 rpm/min)孵育40min，经0.22微米微孔滤膜过滤去除菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱(16mmX 100cm，流速0.8ml/min,去离子水洗脱)检测与大肠杆菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与大肠杆菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
[0017](5)辣椒籽抗菌肽抑菌率分析时将100微升经0.22微米微孔滤膜过滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入96孔酶标板中，再加入等体积的1.0XlO5 CFU/mL的大肠杆菌菌菌悬液作为试验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的辣椒籽抗菌肽溶液作为对照组，37°C培养12 h后用酶标仪测定620nm下吸光值，辣椒籽抗菌肽抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的比值。经抑菌率检测，本发明方法所获得辣椒籽抗菌肽对大肠杆菌菌的抑菌率为90.81%。
【主权项】
1.一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行: (1)以辣椒籽为原料，将其粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比为1:5?1:10，50?200W超声处理20?60min，然后于50?80 °C浸提2?4h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:5?1:10的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，50?200W超声处理20?60min后，30?70°C下100?200rpm/min搅拌浸提4?10h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉； (2)按料液比1:20?1:30的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度20?40°C、pH7?9条件下，揽摔混合30?60min后，于4000?1000rpm离心10?30 min，收集上清液，上清液用0.1moI/LHCL和0.lmol/L NaOH调节pH值4?5以沉淀蛋白，再4000?1000rpm离心10?30 min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白； (3)制备质量百分比3?6%的辣椒籽粗蛋白水溶液，35?70°C下调节pH至2.0?9.0，添加酶酶解I?4h，将酶解液100°C煮沸5?1min灭酶，离心取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末； (4)将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配制成10?40mg/mL的水溶液，在37°C下与1.0X 15CFU/mL细菌悬液混合，轻微振荡孵育反应10?60min后，经0.22微米微孔滤膜过滤除去菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱检测细菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与细菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。2.根据权利I要求所述的辣椒籽抗菌肽的制备方法，其特征在于:细菌悬液为大肠杆菌、宋内志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌中的一种悬液。
【专利摘要】本发明公开了一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，该方法包括提取辣椒籽粗蛋白；应用食品级酶制剂对辣椒籽粗蛋白进行酶解；利用抗菌肽与细菌相互作用并联合凝胶层析对酶解液中的抗菌肽进行分离即得辣椒籽抗菌肽；由蛋白酶水解辣椒籽获得的抗菌肽，具有安全性高、抗菌性强的特点，在食品、饲料及化妆品等行业具有潜在利用价值。该方法利用抗菌肽与细菌结合的特性，实现了靶向性分离，克服常规抗菌肽分离的步骤繁琐、过程大量使用化学试剂的缺点，该发明以辣椒加工副产物为原料，增加了辣椒籽资源的可利用性。
【IPC分类】C07K1/30, C12P21/06, C07K1/36, C07K1/34, C07K1/16
【公开号】CN105132506
【申请号】CN201510621792
【发明人】李莉蓉, 宋风霞, 韩鹏, 陈璇
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月28日