一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种转基因植物材料快速鉴定的方法，具体涉及一种养分高效利用转 基因玉米材料快速鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用生物基因工程技术将能够提高玉 米氮、磷肥利用效率的基因导入玉米，改良玉米自身性状已成为可能。当前，转基因玉米已 经在全世界范围内广泛种植，全球种植的转基因作物面积和比例连年增加，同时随着转基 因技术的快速发展，国外转基因作物大量进入我国。因此，转基因植物的检测技术成为转基 因产品安全性评价的重要技术平台，如何快速有效地鉴定转基因植物、种子等，在转基因植 物研制开发或对转基因产品进行筛选或安全性评价时，对于科研单位、商检、海关和农业执 法部门等具有重要的实用价值。
[0003] 目前，转基因植物的检测技术主要有除草剂鉴定、试纸条鉴定以及PCR鉴定技术。 其中，在植物转基因研究过程中，通常采用选择性标记基因提高转化筛选效率，而草铵膦乙 酰转移酶基因（phosphinothricin acetyl transferase gene，bar)是玉米转基因研究 中常用的筛选标记基因，草铵膦可以强烈抑制植株内的谷氨酰胺合成酶的活性，导致细胞 内氨的迅速积累，随叶绿体结构解体，最后整个植株中毒死亡。因此，利用筛选标记基因的 农艺性状，建立快速有效的非生物鉴定方法非常必要。待玉米生长至5~6叶期时喷洒草 铵膦，8~10d之后，野生型玉米叶片逐渐变黄枯萎，有明显中毒症状，当草铵膦浓度大于 2000mg/L时，野生型植株叶片褐化直至全部死亡，而含有Bar基因的玉米叶片没有黄化症 状，生长正常，表现出对草铵膦的良好抗性，使用该浓度的草铵膦溶液喷洒玉米叶片，即可 准确、有效地鉴定转基因与非转基因玉米植株。因此，该方法可用于鉴定含抗除草剂标记基 因Bar基因的养分高效利用转基因玉米植株。然而喷洒草铵膦除草剂，筛选养分高效利用 的转基因玉米材料的缺点主要是假阳性高、反应速度慢等；若草铵膦没有完全喷洒玉米植 株，玉米植株会在受伤后继续恢复生长，造成假阳性；同时，喷洒除草剂后通常要一周左右 才能看到植株反应效果，鉴选时间较长不利于及时获知结果。
[0004] 在试纸条鉴定中，草铵膦乙酰转移酶基因（phosphinothricin acetyl transferase gene，bar)为抗除草剂基因，编码蛋白一膦丝菌素乙酰转移酶（PAT)。该基因 广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因。养分高效利用 转基因玉米使用Bar基因作为标记基因，它使玉米抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性 成分的草铵膦除草剂，通过Bar试纸条分子检测法能够快速鉴定转基因材料中的Bar蛋白， 检测时取Bar试纸条将标有箭头和"max"端置于玉米叶片研磨上清液中1~2cm左右，一 般等待3~5min，试纸条上端出现质控线，最长反应时间为20min，表示混合液中含有来自 于样品的蛋白，试验结果有效。如果样品含有Bar蛋白，则在质控线下方出现测试线；若不 出现测试线，则表示样品中不含有Bar蛋白，该鉴定方法为快速有效的筛选大量转基因材 料节约大量时间。然而Bar试纸条检测结果呈阳性，也还只是处于"海选"阶段，需要进一 步将初步筛选出的阳性材料进行PCR定性筛选检测，才能最终确定是否真正含有转基因物 质；同时Bar试纸条检测成本较贵，约为25元/样品。
[0005] 在转基因玉米研究和培育时，阳性植株的筛选、插入序列分析、安全检测一般都 离不开分子检测，最常用的分子检测手段是PCR (聚合酶链反应）检测。PCR检测的基础是 提取满足检测需要的基因组DNA，然后以提取的待检测转基因玉米材料基因组DNA为模板 进行PCR扩增，扩增后通过电泳系统分辨目的基因条带，有目的片段出现的样品即为转基 因阳性植株，反之为阴性非转基因植株。然而PCR定性筛选检测，检测费用为每次1000元 左右；在研究或者筛选群体较大（如转基因植株的大批量筛选、遗传规律分析等）时，提取 基因组DNA就会成为一项繁重的工作，并成为检测和筛选速度的一个重要制约因素。因此， PCR鉴定成本较高、方法步骤繁琐，做大量鉴定，运用时有一定的局限性。
[0006] 综上，现有养分高效利用转基因植物鉴定方法鉴定手段单一，要么是苗期喷施除 草剂筛选鉴定，要么是简单的进行Bar试纸条检测，要么是全材料提取基因组DNA进行PCR 验证，方法上太过局限和不灵活。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有简便、快速、准确、灵敏度和特异性 高、经济实用、适合于全生育期检测等特点的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方 法。
[0008] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种养分高效利用转基因玉米材料快 速鉴定的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)除草剂首次筛选：将种植的养分高效利用转基因玉米材料（优选转phyAO、 AMTl-l、DvASN、DvGS2、GPPAT基因玉米材料）在苗期玉米5~6叶一心，喷施浓度为1200~ 1300mg/L (优选浓度为1250mg/L)草铵膦除草剂6~8d后筛选，玉米植株枯萎褐化直至死 亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株初步鉴定为养分高效利用转基因玉米 植株；
[0010] (2)叶片Bar试纸条快速检测：将苗期筛选正常生长的转基因玉米植株叶片在喇 叭口期玉米植株9~10叶一心时，进行Bar试纸条检测，仅出现控制线的试纸条检测结果 为阴性，即为非转基因植株；同时出现控制线和测试线的试纸条检测结果为阳性，即为养分 高效利用转基因玉米植株：
[0011] (3)除草剂二次筛选和基因组的PCR检测：将喇叭口期筛选出的转基因玉米植株 待玉米植株生长到抽雄吐丝期，再次喷施浓度为1200~1300mg/L (优选浓度为1250mg/L) 草铵膦除草剂6~8d筛选，玉米植株枯萎发黄直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下 正常生长植株鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；同时取样除草剂二次筛选后的转基因 玉米叶片用于提取基因组DNA，待药效明显后再对正常生长的玉米材料提取基因组DNA进 行PCR检测。
[0012] 进一步，步骤（2)中，所述Bar试纸条检测是用1. 5ml离心管取管盖大小叶片，加 入0. 5ml提取液反复研磨至匀浆，箭头端向下插入Bar试纸条，待试纸条浸入研磨液10~ 15min后观察结果。
[0013] 进一步，步骤（3)，所述PCR引物为
[0014] phyAO 正向 CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT
[0015] phyAO 反向 TGCCGTTGTACAGACCCAAA
[0016] AMT1-1 正向 TGGTCCGCTACAAGAACG
[0017] AMT1-1 反向 GCTCAGGTAAGCAATGAAAGT
[0018] DvASN 正向 CACCACGAGTTCACCTTCACAG
[0019] DvASN 反向 CATCAATCCAGTTGTAGCCCAC
[0020] DvGS2 正向 CACCCAAGCAACACTCGT
[0021] DvGS2 反向 CACAGGCAGAGGGATACG
[0022] PPAT BamH fw CGCGGATCCGCGATGGCAGCTCCGGAAGATTC
[0023] PPAT Smal rev TCCCCCGGGGGAGAGAGTTTATATATGATGAGTT。
[0024] 本发明首次为养分高效利用转基因玉米材料鉴定提供了一套具有简便、灵活、快 速、准确、经济实用、适合于全生育期检测等特点的检测体系，检测者可以根据鉴定需要灵 活选择某一时期或某一种方法或整套体系进行养分高效利用转基因玉米材料鉴定。实验证 明，本发明提供的转养分高效利用基因phyAO、AMT1-1、DvASN、DvGS2、GPPAT玉米检测体系， 通过苗期和抽雄吐丝期大田除草剂筛选、喇叭口期Bar试纸条快速检测及抽雄吐丝期基因 组DNA的PCR检测，逐步筛选排查非转基因植株，缩小后期精准鉴定范围，大大降低了工作 量和成本。
【附图说明】
[0025] 图1为AMT-I基因扩增程序。
[0026] 图2为PPAT基因扩增程序。
[0027] 图3为ASN基因扩增程序。
[0028] 图4为GS2基因扩增程序。
[0029] 图5为phyAO基因扩增程序。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0031] 实施例1
[0032] (1)除草剂首次筛选：将种植的养分高效利用转基因玉米材料在苗期玉米5~6 叶一