Rna制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以未分解的方式提取生物试样中的RNA的方法，其使用含有碱金 属盐及表面活性剂的RNA提取试剂。
【背景技术】
[0002] 随着基因工程的发展，在病毒的检测、细胞动态分析、体质检查、医药品的奏效检 查等中利用基因检查。作为这些基因检查中的分析对象之一的RNA与DNA相比不稳定，容 易因生物试样中所含的内源性核糖核酸酶及高温?碱处理而分解。因此，在RNA的制备中 需要用于防止其分解的先进技能、多阶段的实验工序、昂贵的专用设备?试剂。
[0003] 例如，作为从生物试样中回收RNA的一般方法，已知通过组合使用蛋白质改性剂 和有机溶剂来溶解被分析物，使内源性核糖核酸酶失活而回收未分解的RNA的异硫氰酸 胍-苯酚-氯仿（AGPC)法（非专利文献1)及热酚法（非专利文献2)。但是，这些方法 均含有抑制核酸扩增反应等酶反应的有机溶剂及高浓度的改性剂，因此，不仅危险性较高， 而且需要用于除去这些物质的多阶段的工序和较长的处理时间，从成本及简便性的方面考 虑，存在问题。
[0004] 另一方面，出于使RNA的制备简便的目的，也开发了一种在不使用有机溶剂的情 况下，使用强离液物质和表面活性剂作为蛋白质改性剂提取RNA，将提取液直接供与酶反应 的方法。例如，已知使用硫氰酸胍和肌氨酰作为改性剂溶解生物试样，一边保护RNA不受内 源性核糖核酸酶的影响而分解，一边进行提取的方法（专利文献1)。该提取液可以直接供 与酶反应。根据该方法，在将提取液供与酶反应之前，不需要除去改性剂的工序，能够比现 有方法更简便地提取RNA。但是，硫氰酸胍等强离液物质及肌氨酰为蛋白质的强改性剂，从 有效的酶反应这样的观点考虑，不优选酶反应体系中存在这些强改性剂。
[0005] 相对于此，作为不抑制之后的酶反应的核酸提取法，已知使用了胆酸、乙醇酸的方 法（专利文献2)。根据本方法，从生物试样中所提取的核酸可以不需要纯化工序及稀释工 序直接供与核酸扩增法等酶反应。但是，本方法无法防止内源性核糖核酸酶导致的RNA的 分解，无法提取未分解的RNA。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本专利第4836795号公报
[0009] 专利文献2 :国际公开第2007/116450号
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1 :Chomczynski&Sacchi(1987)AnalyticalBiochemistry，162 : 156-159.
[0012] 非专利文献2 :水野贵之（2003)生物实验说明（7)
【发明内容】
[0013] 发明所要解决的课题
[0014] 本发明的目的在于，提供一种比现有方法更简便地制备可供试于酶反应的RNA的 方法。
[0015] 用于解决课题的技术方案
[0016] 本发明涉及一种用于提取生物试样中的RNA的试剂，其含有碱金属盐及表面活性 剂。
[0017] 优选碱金属盐为碱金属卤化物。
[0018] 优选碱金属盐为氯化锂。
[0019] 优选表面活性剂含有乙醇酸类。
[0020] 优选表面活性剂还含有脱氧胆酸类。
[0021] 另外，本发明涉及一种RNA提取试剂盒，其具有所述用于提取生物试样中的RNA的 试剂。
[0022] 另外，本发明涉及一种提取生物试样中的RNA的方法，该方法包括：使用所述用于 提取生物试样中的RNA的试剂或RNA提取试剂盒。
[0023] 发明的效果
[0024] 根据本发明，可在未分解状态下比现有方法更简便地制备可供与酶?化学反应等 试验的RNA。
【附图说明】
[0025] 图1为示出了以细胞为被分析物提取RNA并供与RT-PCR的结果的图。
【具体实施方式】
[0026] 下面，对本发明详细地进行记载。
[0027] 在本发明中，为了从生物试样制备未分解性RNA，使用碱金属盐和表面活性剂，在 防止RNA因被分析物内存在的核糖核酸酶导致的分解的同时，制备可供试于之后的酶反应 的RNA〇
[0028] 在本发明中，所谓生物试样，可例示：动物或植物的细胞、组织、全血、血清、淋巴 液、组织液、尿、精液、阴道液、羊水、眼泪、唾液、汗等体液、源自于外来体等细胞的卵泡、粪 便、痰、细菌、病毒等，但只要为含有核酸的物质即可，不限定于此。
[0029] 在本发明中，所谓RNA，可例示：信使RNA及转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、核仁小 分子RNA、微RNA等不可翻译RNA等，但只要为含有核糖核苷酸的聚合物的物质即可，不限定 于此。
[0030] 就RNA的一般制备方法、即利用RNA对固相载体的吸附的方法及利用有机溶剂及 水溶性高分子、表面活性剂的添加导致的RNA的不溶化的方法而言，不仅需要用于纯化处 理液的复杂操作，而且根据RNA的分子量在回收效率上有差别，有时无法得到目标RNA。另 一方面，本发明中的RNA制备方法可将RNA提取液直接供试于之后的分析，处理液具有无损 失地含有被分析物中所含的所有分子量的RNA这样的优点。
[0031 ] 在本发明中，用于提取RNA的RNA提取试剂含有碱金属盐作为RNA保护剂。
[0032] 所谓本发明中的碱金属盐，可例示：锂盐、钠盐、钾盐、铷盐、铯盐。可优选例示：氯 化锂、溴化锂、碘化锂、醋酸锂、氢氧化锂、氟化钠、氯化钠、溴化钠、碘化钠、醋酸钠、焦磷酸 钠、硫氰酸钠、硫酸钠、亚硫酸钠、二亚硫酸钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、酒石酸钠、硝酸钠、氟 化钾、氯化钾、溴化钾、碘化钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、硫酸钾、氟化铷、氯化铷、溴化铷、碘化 铷、醋酸铷、氯化铯、溴化铯、碘化铯、醋酸铯，但不限定于此。可更优选例示碱金属卤化物。 可进一步优选卤化物中的离液效果较小的氯化锂。这些碱金属盐可以单独使用，也可以组 合使用。
[0033] 碱金属盐具有RNA保护效果，另一方面，不会成为核酸相关酶的辅因子，与其它产 生可成为辅因子的多价阳离子的金属盐相比，具有对酶活性造成的影响较小这样的优点。
[0034] RNA提取试剂中所含的碱金属盐的浓度可以由本领域技术人员容易地确定最佳 值，但作为一个例子，优选〇. 2M以上且饱和浓度以下，更优选0. 3M以上且5. 0M以下，进一 步优选0. 3M以上且2. 5M以下。若碱金属盐的浓度过低，则无法保护RNA免受内源性核糖 核酸酶导致的分解，若浓度过高，则可以保护RNA，但存在抑制之后的酶反应的倾向。
[0035] 在本发明中，RNA提取试剂含有表面活性剂作为被分析物溶解剂。所谓本发明 中的表面活性剂，可例示离子型、非离子型、双离子型表面活性剂。可优选例示：Tween20、 Tween40、Tween60、Tween80等Tween类、TritonX-100、TritonX-114、TritonXL-80N等 Triton类、Nonidet类、NP-40等非离子型表面活性剂、胆酸类、脱氧胆酸类、乙醇酸类等阴 离子型表面活性剂，可更优选例示：TWeen20、TritonX-100、脱氧胆酸、乙醇酸，但只要为不 抑制酶反应的表面活性剂即可，不限定于此。这些表面活性剂可以单独使用，也可以组合使 用。
[0036] RNA提取试剂中所含的表面活性剂的浓度可以由本领域技术人员容易地确定最佳 值，但在使用胆酸类、脱氧胆酸类、乙醇酸类的情况下，其浓度优选为ImM以上。若表面活性 剂的浓度过低，则存在无法使生物试样溶解的倾向。
[0037] 在本发明中，RNA提取试剂可以含有缓冲剂。作为本发明中的缓冲剂，可优选使 用磷酸缓冲液及两性离子缓冲液等缓冲剂。其中，优选MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、 M0PS0、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPS0、P0PS0、HEPPS0、EPPS、Tricine、Tris、Bicine、 TAPS、CHES、CAPS0、CAPS等两性离子缓冲液，特别优选TAPS。这些缓冲剂可以单独使用，也 可以组合使用。
[0038] 在本发明中，RNA提取试剂可以含有具有源自于生物试样的异物导致的酶反应抑 制降低效果的白蛋白等蛋白质成分、多胺、环糊精、海藻糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙二 醇等水溶性尚分子。
[0039] 在本发明中，RNA提取试剂可以含有用于防止在冰点下的冻结的甘油、甜菜碱、蔗 糖等防冻剂。
[0040] 在本发明中，RNA提取试剂可以含有用于确保核酸酶活性失活的螯合剂及核酸酶 抑制剂、DTT(二硫苏糖醇）等还原剂、用于之后的酶反应的DMS0及甲酰胺这样的有机溶剂。
[0041] 生物试样和RNA提取试剂的混合比优选为9:1~1:999,更优选为4:1~1:499， 进一步优选为1:1~1:99。
[0042] 在本发明中，将生物试样和RNA提取试剂混合后，在RNA提取处理时，可以物理破 碎生物试样，也可以与例如利用冻结融化的破碎及利用均质器的物理破碎法等组合。另外， 根据本发明，在将生物试样和RNA提取试剂混合之前，即使不进行破碎操作也可提取RNA。
[0043] 将生物试样和RNA提取试剂混合后，为了从生物试样中提取RNA，可以实施热处 理。热处理温度优选为〇°C以上且100°C以下，更优选为30°C以上且90°C以下，进一步优选 为50°C以上且80°C以下。若温度过低，则存在提取效率降低的倾向，若过高，则存在RNA分 解的倾向。热处理时间优选为30分钟以下，更优选为15分钟以下。若处理时间过短，则存 在提取效率降低的倾向，若过长，则存在RNA分解的倾向。
[0044] 在本发明中，对于RNA提取液，不需要进一步的纯化工序及稀释工序等，可将RNA 提取液混入酶反应溶液直接作为底物，引发核酸扩增反应等酶反应。作为使其反应的酶，例 如可以举出：脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶等核酸酶、蛋白酶、肽 酶等蛋白酶、DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA 依赖性RNA聚合酶、耐热性聚合酶、链置换聚合酶、末端转移酶等聚合酶、连接酶、重组酶、 溶解酶、纤维素酶等。RNA提取液和酶反应溶液的混合比优选为1:999~999:1，更优选为 1:99~99:1，进一步优选为1:49~49:1。
[0045] 在本发明中，RNA提取液可以与溴化乙锭、SYBR(R)Green、PicoGreen(R)等核酸荧 光标记试剂及荧光标记探针混合，对含有的RNA进行检测。另外，也可在荧光标记试剂存在 下将RNA提取液供与核酸扩增反应，实时监控扩增反应。另外，也可将RNA提取液供与测序 反应。
[0046] 在本发明中，所谓核酸扩增反应，为PCR法所代表的使核酸序列扩增的方法，例如 除PCR法以外，可例示：LCR(连接酶链反应）法、SDA(链置换扩增反应）法、RCA(滚环扩增 反应）法、CPT(循环探针技术）法、Q-P复制扩增技术法、ICAN(恒温和嵌合引物引发的核 酸扩增反应）法、LAMP(DNA的环介导等温扩增）法、NASBA(基于核酸序列的扩增方法）法 及TMA(转录介导扩增技术）法等公知的方法，但并不限定于这些方法。
[0047] 在本发明中，可将具有与RNA提取液中所含的部分目标核酸互补的核酸的分子、 抗体或者单链核酸结合蛋白质等具有特异性结合能力的分子及目标核酸混合，使其特异性 结合。简言之，可使用RNA提取液进行Southern印迹、Northern印迹、实时PCR、利用标记 核酸探针等的特异性核酸的标记、检测、纯化、分离等。
[0048] 在本发明中，也可将RNA提取液供与离子交换柱、凝胶过