一种具有益生元效应的莲子低聚糖单体的快速分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物活性成分提取分离技术领域，具体涉及一种具有益生元效应的莲 子低聚糖单体的快速分离方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界各国经济实力的增长与人类生活质量的不断提高，人们对食品功能的要 求也在不断发生改变，而对保健食品的需求量也随之增加。在众多保健食品中，低聚糖由于 具有明确的化学结构和显著的生理功效，已引起国内外研究者的广泛关注。功能性低聚糖 是由2~10个单糖经特定糖苷键连接而成的低度聚合糖，已被证实为有效的双歧杆菌增殖 因子之一，并具有促进人体肠道内益生菌增殖、抗龋齿和降血脂等优良的生理活性，因而倍 受世人瞩目，产销量在功能性食品中名列前茅。而低聚糖的聚合度对益生菌的利用率也具 有重要影响，其吸收能力一般随分子量的减小而增大，同时对抗致病菌能力也有一定的影 响，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越强。
[0003] 低聚糖的功能性与糖的化学结构和构型密切相关，因此，低聚糖的定性和定量分 析对其在生物医学和功能性食品方面的表现有着重要的影响。如今，硅胶、活性炭、阴离子 交换和凝胶层析技术等一系列的分离方法已被单独或者组合运用在功能性食品领域，用于 制备益生元。目前不同聚合度低聚糖的分离已经在上述分离方法中逐步实现，但由于相邻 聚合度的低聚糖由于理化性质十分接近，没有紫外吸收，热稳定性低，不含有带电荷基团， 这使同时快速分离相同聚合度的低聚糖仍然是一个具有挑战性的工作。因此，建立具有高 分辨率、自动化和可实现的制备方法就显得尤为必要。而与传统柱层析法存在操作复杂、 填料昂贵等问题相比，液相色谱法具有分辩率高、速度快、重复性高、色谱柱可反复使用、可 自动化操作、分析精确度高等特点，能较为准确地鉴定产物和分离情况。闪式制备色谱技 术，根据所施加的压力可以分为快速色谱（〇. 1-5/10 bars)或中压制备色谱（MPLC，5/10-50 bars)。闪式色谱系统最初用于快速纯化合成化合物的应用，近年来这种系统已逐渐应用在 复杂天然产物提取混合物的分离中。相比于高效液相色谱法和高速逆流色谱法，其制备量 大，样品上样量可从毫克级到百克不等，分离时间较短，同时分离柱填料能够自主填充，增 加了分离选择性，可有效节约生产成本，在天然产物的分离纯化研究工作中发挥着重要作 用。同时，一般的制备色谱只配有紫外线检测器，这并不适用于检测没有紫外吸收的化合 物，如碳水化合物；而采用苯酚-硫酸法比色等离线检测法，常使用有害的化学试剂，且特 异性差、分析时间较长。
[0004] 莲子是我国重要的出口创汇特色农副产品之一，除福建、江西两省为主要产区外， 在浙江、湖南、江苏、湖北、河北、台湾等省亦均有商业栽培。莲子为药食两用食品，除含有丰 富的淀粉、蛋白质、生物碱和类黄酮外，还含有超氧化物歧化酶、低聚糖、多糖等功效成分。 而低聚糖作为莲子的活性成分之一，目前研究报道较少，有大量制备以进一步深入研究构 效关系的需求。因此，本发明以莲子为材料，将闪式制备色谱结合蒸发光散射与亲水色谱联 用技术(MPLC-ELSD-HILIC)运用于在线监测莲子低聚糖单体的分离过程，建立一种莲子中 低聚糖单体的快速分离纯化方法，其具有高自动化、高分辨率、高产量与安全性等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有益生元效应的莲子低聚糖单体的快速分离方法， 该方法简单，易于操作，能实现相同聚合度的低聚糖的分离，且所得低聚糖单体具有益生元 效应。本发明可填补国内莲子低聚糖高效制备分离技术的空白，为莲子低聚糖的开发利用 提供基础，有助于提升莲子产业价值，拓展莲子深加工副产物利用的有效途径，同时也可为 其他天然低聚糖的高效快速制备提供新的方向。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种具有益生元效应的莲子低聚糖单体的快速分离方法，其是以新鲜莲子为原料，经 选料烘干、粉碎过筛、加水复配、水洗淀粉、恒温回流提取、抽滤、醇析、离心浓缩、冷冻干燥、 MPLC分离、MPLC二次分离得莲子低聚糖单体粉末。
[0007] 该方法具体包括以下步骤： 1) 选料烘干：选取颗粒饱满、无损伤的新鲜莲子，筛选去芯后放入鼓风干燥箱中，于 40~50°C下烘至水分含量为4~7% ; 2) 粉碎过筛：将步骤1)干燥后的莲子粉碎，过40目筛； 3) 加水复配：取步骤2)所得莲子粉末，按料液比1:5加入去离子水混匀进行复配； 4) 水洗淀粉：将步骤3)所得复配料液过100目筛，并用莲子重量4~6倍的去离子水冲 洗滤渣，合并滤液后置于4°C条件下静置沉淀8 h，离心去除沉淀，再将所得上清液与冲洗后 的莲子滤渣合并： 5) 恒温回流提取：将步骤4)所得上清液和莲子滤渣于75~85 °C下恒温回流提取1. 5~2 h； 6) 抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣； 7) 醇析：将步骤6)所得滤液于60~65°C下浓缩至原体积的1/5~1/4后加入浓缩液3~5 倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4°C下静置10~12 h ; 8) 离心浓缩：将步骤7)所得溶液离心后去除沉淀，上清液于55~65°C下真空旋转蒸发 浓缩至原体积的1/3~2/5 ; 9) 冷冻干燥：将步骤8)所得浓缩液经冷冻干燥，得莲子低聚糖粗糖粉末； 10) MPLC分离：将步骤9)所得莲子低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为 0. 1~0. 2 g/mL的溶液，然后将溶液经0. 22 y m微孔滤膜过滤后注入MPLC进行分离，根据 保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于55~65°C下真空旋转蒸发回收溶剂后， 经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末； 1UMPLC二次分离：取步骤10)所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10)的操作 和色谱条件进行二次进样，收集相同保留时间的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得莲子 低聚糖单体粉末。
[0008] MPLC的分离系统包括中压特制玻璃柱（36X460 mm)，色谱栗、DAD紫外全波长扫 描器(检测波长范围为190-840 nm)和FLASH ELSD蒸发光散射检测器，自动馏分收集器和 手动样品加载模块； 所述中压特制玻璃柱为Claricep Flash HILIC亲水柱，其填料粒径为20-35 y m，孔径 100A，比表面320 m2/g，碳含量5. 0% ; 所述FLASH ELSD蒸发光散射检测器的检测条件为：吹扫氮气压力为2. 5~3. 5 bar，漂 移管温度85~95°C。
[0009] MPLC分离中的上样体积为1 mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为 30~45mL/min，柱温为 25°C ; 流动相比例变化的具体程序为：流动相中乙腈比例为85~90%保持15~20min，随后将 乙腈比例在30~35min内降至65~60%，保持50~60min，再将乙腈比例上升至85~90%，保持 15~20min〇
[0010] 所得莲子低聚糖单体粉末可用于制备具有调节胃肠道菌群功效的保健食品。
[0011] 本发明所述具有益生元效应的莲子低聚糖单体的快速分离方法具有以下优点： (1)本发明采用制备型中压液相色谱系统对莲子低聚糖单体进行分离纯化，并通过DAD 和FLASH ELSD进行实时在线监测，可使提取液中的杂质成分与目标物成分明确，达到很好 的分离效果；且制备色谱仪可针对性地自动收集莲子低聚糖单体目标峰，从而不需使用传 统人工手动操作进行收集，也不需采用化学方法(如苯酚硫酸法）检测碳水化合物，可有效 避免环境污染，并减少人力成本，同时还便于控制产品质量，所收集的各莲子低聚糖单体纯 度可达95%以上。此外，使用的分离柱填料能够自主填充，增加了分离选择性。
[0012] (2)本发明采用制备型中压液相色谱技术进行分离，可使莲子低聚糖从提取液中 转移至乙腈与水的混合溶液中，不仅可在短时间内提高目标物的浓度，同时由于乙腈溶液 易于蒸发回收，减少了传统水蒸发操作中的能量消耗。
[0013] (3)传统糖分离的方法需要经过脱脂、脱蛋白、大孔吸附树脂吸附色素等前处理工 艺，并需结合离子交换层析、凝胶过滤或排阻层析对各步骤收集的样品进行多次分离或纯 化，其操作步骤繁琐，且终产品制备量很低。采用本发明方法最多只需上样5次，所分离制 备出的莲子低聚糖单体即可基本满足结构分析的需求，同时，其可对小聚合度低聚糖的同 分异构体进行有效分离，这对于进一步研究莲子低聚糖构效关系、充分利用我国莲子资源， 开发莲子低聚糖产品具有重要意义。
[0014] (4)现有技术中通常将氨基键合相用于液相色谱中小分子碳水化合物的分析。但 氨基键合硅胶需要较长的平衡时间，同时氨基柱中硅胶固定相性质较为活泼，使用时易造 成不可逆吸附现象，导致谱图峰型恶化。本发明选用酰胺基团为主基团的亲水色谱，与氨基 相比其活性较低，碱性较弱，且物质在酰胺基键合相上的保留受pH的影响较小，不易产生 配体流失，具有较高回收率，同时采用丙基酰胺的键合硅胶作为填料，此填料制造时使用正 硅酸酯处理硅胶表面，减少了表面孤立硅羟基的数量，降低了硅胶表面硅羟基的活性，可有 效避免极性化合物吸附过强的问题。在反相体系中此色谱柱材料与C 1S材料具有相反的保 留特性，而在正相体系中其较氨基的保留力较弱，从而可以洗脱或保留在正相条件下难以 洗脱或者在反相条件下保留很弱的物质。且其在含水流动相中具有良好的稳定性，弥补了 传统氨基糖柱在此方面的缺点。所采用的色谱柱填料成本较低，操作压力较小。
[0015] (5)国内已有使用硅胶柱用于较大剂量低聚糖分离制备的研究报道，其分离工艺 尚存在产物分离度不高，检测手段繁琐等问题，同时只能对不同聚合度的低聚糖进行分离。 本发明可有效弥补上述不足，用于分离莲子低聚糖的同分异构体，且其分离效果较前者有 较大地提升。
[0016] (6)由于高效液相色谱等其他高精密仪器对分析样品的色泽、纯度等要求比较高， 通过简单处理得到的提取液不能直接进样分析，而若在进行高效液相色谱分离前利用本发 明预处理方法对进样溶液进行前处理(可