多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫细胞技术领域，主要设及多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方 法。
【背景技术】
[0002] 慢性乙型肝炎（CHB)在我国是高发传染病，由C皿逐步发展成肝硬化，到最后发展 成肝癌是最常见的疾病进展部曲"。在我国80%W上的肝癌患者乙型肝炎病毒学化BV) 指标阳性，并且研究显示皿SAg阳性的乙肝患者发生肝癌的机会比阴性者高100倍W上，可 见有效清除皿V对于阻断疾病进展、预防肝癌的发生非常重要。急性乙型肝炎和1-2%的慢 性乙肝患者通过自身抗皿V免疫反应有效的清除病毒，在较短的时间内完成皿eAg血清学 转换和皿sAg血清学转换，并建立起长期的免疫保护机制。进一步对患者发生皿sAg血清 学转换前、转换中及转换后的临床样本的细致分析发现，抗原特异性T细胞作为机体清除 病毒的主要效应性细胞，数量和频率的变化与病毒清除的效率和临床预转归密切相关。因 此建立高效的抗原特异性细T细胞的扩增方法，对于研究皿V清除的免疫机制、有效评判临 床预后具有重要意义。
[0003] 为了解决抗原特异性T细胞扩增效率低下的问题，本发明提供了一种应用抗原特 异性肤库联合细胞因子白细胞介素-7 (比-7)和Anti-CD28抗体协同进行细胞体外扩增的 方法。发明通过将急性乙型肝炎恢复期患者的外周血单个核细胞分离后，用皿V抗原肤库 联合细胞因子白细胞介素-7 (比-7)和Anti-CD28抗体进行刺激，有效扩增抗原特异性T细 胞，包括皿V表面抗原特异性T细胞和皿V核屯、抗原特异性T细胞。此方法不仅能提高抗 原特异性T细胞扩增的效率，而且能有效区分抗原特异性T细胞反应的表位特征，对于研究 皿V清除的免疫机制、有效评判临床预后具有更为重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种多克隆抗皿V免疫细胞的扩增方法，具体步骤为： 阳0化](1)选择急性乙型肝炎恢复期患者外周血的单个核细胞进行分离培养；
[0006] (2)进行皿V特异性抗原肤库联合细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体协同 刺激分离培养的外周血单个核细胞；
[0007] (3)对获得的外周血单个核细胞进行保存。
[0008] 外周血单个核细胞（PBMC)分离方法包括但不限于：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离 屯、法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation),用此方法分离PBMC纯度可达 95 %，淋己细胞约占90 %，其中T淋己细胞占80 %，B淋己细胞占4~10%。ficol1-hypaque 混合溶液，又称淋己细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1. 077 + 0.Ol。
[0009] IL-7在免疫细胞增殖、成熟及活化过程中具有举足轻重的作用，能增强T细胞对 特异性抗原刺激诱导的增殖能力。Anti-CD28抗体通过模拟T细胞的TCR激活共刺激信号， 两者与抗原特异性肤库的联合，明显提升了抗原特异性T细胞扩增的效率。
[0010] 进一步，皿V特异性抗原肤库为化学合成皿V特异性抗原肤库，包括皿V表面抗原 肤库和皿V核屯、抗原肤库。皿V表面抗原肤库包括下下列4种：皿VENV1-110、皿VENV 101-205、皿VENV196-300、皿VENV291-389,所述皿V核屯、抗原肤库包括下列2种：皿V core1-115、皿Vcorel06-214。选用运6种皿V特异性抗原肤段分别刺激培养的外周血单 个核细胞。
[0011]选择急性乙型肝炎恢复期患者其皿V血清学标志物为：皿sAg、皿sAb\皿6八6\ 皿cAb+。其中上角标的正（+)负（-)分别表示阳性和阴性。
[0012] 一种多克隆抗皿V免疫细胞的扩增方法，具体步骤为： 阳〇1引 （1)材料选取：选取急性乙型肝炎恢复期患者的外周血她sAg、皿sAb\WeAb\ 皿cAbO;
[0014] (2)采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离屯、法分离外周血单个核细胞；
[0015] (3)细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体共同联合6种单独的皿V特异性抗 原肤库刺激分离培养的外周血单个核细胞；
[0016] (4)对得到的外周血单个核细胞进行保存。
[0017] 进一步的，可W对获得的外周血单个核细胞在液氮中进行长期保存，当需要时细 胞复苏后进行检测。
[0018] 本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含白细胞介素-7、 Anti-CD28抗体和皿V特异性抗原肤库，所述皿V特异性抗原肤库选自下列6种皿V特 异性抗原肤库中的一种：皿VENV1-110、皿VENV101-205、皿VENV196-300、皿VENV 291-389、皿Vcore1-115、皿Vcorel06-214。该药物组合物能够有效增加外周血中抗原特 异性T细胞的扩增效率。
[0019] 一种多克隆抗皿V免疫细胞的检测方法，具体步骤为：
[0020] (1)选择急性乙型肝炎恢复期患者外周血的单个核细胞进行分离培养；
[0021] (2)进行皿V特异性抗原肤库联合细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体协同 刺激分离培养的外周血单个核细胞；
[0022] (3)对得到的外周血单个核细胞进行化ISPOT法检测。
[0023] 进一步，皿V特异性抗原肤库为化学合成皿V特异性抗原肤库，包括皿V表面抗 原肤库和皿V核屯、抗原肤库。皿V表面抗原肤库包括下列4种：皿VENV1-110、皿VENV 101-205、皿VENV196-300、皿VENV291-389,所述皿V核屯、抗原肤库包括下列2种：皿V core1-115、皿Vcorel06-214。选用运6种皿V特异性抗原肤段分别刺激分离培养的外周 血单个核细胞。
[0024] 选择急性乙型肝炎恢复期患者其皿V血清学标志物为：皿sAg、皿sAb\皿6八6\ 皿cAb+。其中上角标的正（+)负（-)分别表示阳性和阴性。 阳0巧]一种多克隆抗皿V免疫细胞的检测方法，具体步骤为：
[0026] (1)材料选取：选取急性乙型肝炎恢复期患者的外周血她sAg、皿sAb\WeAb\ 皿cAbO;
[0027] (2)采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离屯、法分离外周血单个核细胞； 阳02引 （3)细胞因子白细胞介素-7、Anti-CD28抗体联合皿V表面抗原肤库和/皿V核屯、 抗原肤库刺激细胞；
[0029] (4)刺激后获得的抗原特异性T细胞通过化ISPOT法进行检测。
[0030] 进一步，所述多克隆抗皿V免疫细胞的检测方法包括检测获得的抗原特异性T细 胞分泌干扰素（IFN-丫）的情况。
[0031] 本发明的目的在于提供上述方法制备抗皿V特异性免疫细胞、及其他们的检测方 法。
[0032] 本发明的有益效果：
[003引 （1)本发明选用皿V表面抗原肤库和核屯、抗原肤库进行细胞体外扩增，涵盖了皿V表面抗原和核屯、抗原的全部抗原表位，抗原特异性T细胞的检出效率显著提升。
[0034] 似本发明选用皿V表面抗原肤库和核屯、抗原肤库联合细胞因子白细胞介 素-7 (比-7)和Anti-CD28抗体协同进行细胞体外扩增的方法，提升了抗原特异性T细胞的 扩增效率。
[0035] (3)本发明选择急性乙型肝炎自愈患者的外周血单个核细胞进行体外刺激，此类 人群已经建立了皿V免疫保护机制，显著增加了抗皿V特异性T细胞扩增的效率。
【附图说明】
[0036] 图1肤库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激细胞的ELISPOT检测结果
[0037] 图2单纯肤库刺激细胞的化ISPOT检测结果 阳03引 图3肤库联合IL-7刺激细胞的ELISPOT检测结果
[0039] 图4肤库联合Anti-CD28抗体刺激细胞的化ISPOT检测结果 W40] 图5不同人群多克隆抗皿V免疫细胞的检测结果
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可W理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 W对运些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0042] 实施例1材料的选择
[0043] 收集解放军第302医院急性乙型肝炎恢复期患者的血液3份，选择乙肝肝炎血清 学标志物检查结果（皿V血清学标志物检查）为：皿sAg、皿sAb\皿646\皿〇46+的样本进 行后续实验。
[0044] 实施例2外周血单个核细胞分离
[0045] 1.静脉取血（实施例1中血液）8ml，加入含肝素溶液（10~50u/ml血样本）的