豌豆抗白粉病等位基因er1-7的Indel标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病理和农作物抗病遗传育种领域，具体设及一种与魏豆抗白粉病 erl等位基因e;rl-7共分离的Indel标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 由白粉菌巧巧Si地ePisi化C.)引起的魏豆白粉病是世界性的重要病害。在 生产上造成25%~50%的产量损失，严重感染的魏豆品种损失可达80%W上（Nisaret al.,2011;Fondevillaet曰1.,2012)。魏豆白粉病在我国南、北魏豆产区均有的发生。气 候条件适宜的情况下，感病品种的侵染率高达100%，极大地影响魏豆产量和品质，造成严 重的经济损失（彭化贤等，1991)。
[0003] 种植抗病品种是防治魏豆白粉病最为经济、有效且环境安全的一种方法。目前，国 外已经鉴定了大量的抗白粉病魏豆资源，并在抗性资源中鉴定了 3个独立遗传的抗白粉病 基因，包括两个隐性基因（erl,er2)和一个显性基因巧r3)(Harlandetal. , 1948!Heringa etal.，1969)。迄今，除在魏豆资源JI2480中鉴定抗性基因er2和在一个魏豆野生种 P.化Ivum中鉴定Er3外，大量抗性资源筛选和遗传分析方面的研究表明，许多不同地理起 源的抗白粉病魏豆资源的抗性均由隐性基因erl控制（Tiwarietal., 1997;化afooret al.，2012;Liuetal.，2003;Vaidetal.，1997)。因此，目前生产中应用的抗白粉病魏豆 资源的抗性均由erl控制。erl基因的抗性机制是抑制病原菌对寄主表皮细胞的侵入，表现 高抗或免疫，抗性不受环境条件的影响，具有广谱、持久抗性，已在欧洲、北美洲及澳大利亚 的魏豆育种中广泛应用（Fondevillaetal. , 2007)。隐性抗病基因erl和er2分别被定位 在魏豆遗传图谱的第6连锁群（LGVI)Olmmermanetal.，1994)和第3连锁群（LGIII) 化atochetal. , 2010)上，而显性基因化3在魏豆遗传图谱上的位置还不确定（Fon化villa etal. , 2007) 〇
[0004] 最近，Hump虹yetal. (2011)和化vanetal. (2011)等研究发现，魏豆抗白粉病 基因erl是由与大麦感白粉病基因（MLO)序列同源PsMLO功能丧失而产生的。在自然条 件下，魏豆PsMLO同源序列发生碱基缺失、插入、替换等导致不同的erl等位基因产生，即 e;rl-l、e;rl-2、e;rl-3、e;rl-4 和e;rl-6(Hump虹yetal.,2011;Sunet日1.,2015)。最近， 通过化学诱变剂处理魏豆感白粉病品种也获得了erl另一个等位基因erl-5任ereiraet al., 2010)。随后，基于不同分子标记技术，Pavan等（2013)和Sun等（2015)开发了erl 的6个等位基因的功能分子标记，除了等位基因erl-5和erl-6的功能标记已在遗传群体 中验证，其它4个等位基因的功能标记的有效性尚未被验证。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记，基于 该标记的试剂盒及制备方法，W及所述标记或试剂盒在筛选抗白粉病魏豆种质资源方面的 应用。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记，其特征在于，用于扩增所述 Indel标记的引物具有如下核巧酸序列：
[0008] InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG ；
[0009] InDel111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT ；
[0010] 所述引物扩增的与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为 183bp，核巧酸序列如Seq ID No. 3所示。
[0011] 用于筛选包含魏豆抗白粉病基因erl-7的魏豆种质资源的试剂盒，其特征在于， 包括权利要求1所述的Indel标记引物；
[0012] 所述Indel标记引物的核巧酸序列如下：
[0013] InDel111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG ；
[0014] InDel111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT ；
[0015] 所述引物扩增的与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为 183bp，核巧酸序列如Seq ID No. 3所示。
[0016] 所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂；
[0017] 所述PCR反应所需的试剂包括：dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2\ PCR反应缓冲液、标 准阳性模板、双蒸水和/或PCR MasterMix ;
[001引所述电泳所需的试剂包括：TE缓冲液、聚丙締酷胺、琼脂糖、四甲基乙二胺、甲醒、 硝酸银。
[0019] 所述试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述Indel标记 引物；
[0020] 所述Indel标记引物的核巧酸序列如下：
[0021] InDel 111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG ；
[0022] InDelll 1-120-R：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT〇
[0023] 组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂；
[0024] 所述PCR反应所需的试剂包括：dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2\ PCR反应缓冲液、标 准阳性模板、双蒸水和/或PCR MasterMix ;
[0025] 所述电泳所需的试剂包括：TE缓冲液、聚丙締酷胺、琼脂糖、四甲基乙二胺、甲醒、 硝酸银。 阳026] 所述Indel标记或所述试剂盒在鉴定包含魏豆抗白粉病基因e;rl-7的魏豆种质资 源方面的应用，包括如下步骤：
[0027] (1)采用所述Indel标记引物对待测魏豆材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述 Indel标记引物的核巧酸序列如下：
[0028] InDel 111-120-F ：GGAGTTAAGGAACGAACTTTGG ；
[0029] InDel 111-120-R ：CCATGTCTGCGTCTGTATCTTT ；
[0030] (2)对扩增结果进行电泳检测；
[0031] (3)从电泳结果中筛选出与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条 带一致的材料；
[0032] 所述与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记特征条带为183bp，核巧酸序 列如SeqIDNo. 3所示。 阳03引所述PCR扩增的反应体系为：魏豆基因组DNA化g/y 1，2 X PCR MasterMix 0. 4 y 1/ y 1，上下游引物各0. 2 y mol/l，其余为双蒸水。
[0034] 所述PCR扩增的反应条件为：95°C预变性5分钟；W94°C30秒，45°C-63°C30秒， 72°C30秒为1个循环，35个循环；72°C10分钟。
[0035] 所述电泳检测指，采用6%的聚丙締酷胺凝胶或者3. 5%的琼脂糖凝胶，于120V恒 功率电泳分离，最后银染显色。
[0036] 本发明根据抗病品种G0003967中克隆到的抗白粉病基因erl-7和感病品种巧 魏6号的候选基因PsMLOl序列比对结果，获知erl-7与PsMLOlcDNA序列之间存在IObp 碱基缺失（111-120处碱基缺失），进而采用PrimerPremier5.0软件在该序列缺失位点 两侧设计引物，开发功能性标记。所述标记为插入缺失标记（Indel标记），并将其命名为 InDellll-120,该标记的上、下游引物分别位于PsMLOl基因的第一个外显子和第一个内含 子上，且该标记InDel111-120与基因erl-7的遗传距离为OcM,二者紧密连锁且共分离，因 此该Indel标记可用于筛选含erl-7的魏豆材料的分子标记辅助育种工作。
[0037] 本发明首先验证了所述Indel标记及其引物的有效性和特异性，即用G0003967和 巧魏6号基因组DNA为模板进行PCR扩增，发现标记InDel111-120能在亲本间呈现多态性， 在抗病亲本G0003967上扩增出183bp的目的条带，而在感病亲本巧魏6号上扩增出193bp 的条带（图1)。随后，用所述Indel标记检测了巧魏6号与G0003967杂交衍生的Fz群体 中的102个单株的基因型，发现InDellll-120在Fz群体中的基因型与F3群体的每一个株 系的表现性一一对应（图1)，进一步表明该标记InDellll-120是与erl-7紧密连锁共分离 的共显性功能标记，证实了所述Indel标记在筛选抗白粉病基因erl-7中的准确性。
[0038] 本发明提供了一种与魏豆抗白粉病基因erl-7共分离的Indel标记，其特征在 于，用于扩增所述Indel标记的上下游引物具有分别如SeqIDNo. 1和