EB病毒编码的microRNA BART10反义寡核苷酸的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及邸病毒编码的microRNABARTlO反义 寡核巧酸用于制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂上的应用方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（化SO地aryngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿 瘤，由于发病部位隐蔽，难于早期发现，且极易发生转移，初诊患者颈部淋己结转移率高达 80 %。放射治疗是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60~70 %的患者能取得较好的疗 效，但仍有30~40%的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡 的主要因素之一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此筛选新的鼻咽癌早 期诊断及预后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义；同时相比 传统的放化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法对防 治鼻咽癌的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，因此筛选鼻咽癌基因治疗的祀 点也同样意义重大。
[0003] 鼻咽癌的发病与邸病毒巧psteinBarrvirus,邸V)感染密切相关。邸V是一种 普遍存在的人类瘤疹病毒，可W感染全球95%左右的成人人口，除偶尔有一小部分人也会 引起传染性的单核细胞增多症外，大部分被感染者不会出现任何的临床症状，绝大多数情 况下邸V可W在宿主体内长期潜伏感染。然而，在某些情况下潜伏感染的邸V会导致恶性 肿瘤的发生，包括B细胞来源的伯基特和何杰金氏淋己瘤，W及上皮细胞来源鼻咽癌和胃 癌等。邸V导致恶性肿瘤发生的机制目前尚未完全明了，可能与邸V本身编码一系列基因的 表达有关，如邸V编码的潜伏膜蛋白ULatentMembraneProteinLLMPl)作为一种致瘤蛋 白，能激活许多宿主细胞内癌基因的表达，抑制抑瘤基因的结构和功能。
[0004]EBV作为双链DNA病毒其基因组大小约为170化，除了可转录一系列蛋白编码基 因，最近发现EBV还可编码一类微小RNAOnicroRNA，miRNA)分子，目前已发现EBV可编 码25个miRNAs前体，加工成44个成熟的miRNAs，且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上 成簇分布，可W分为BART和BHRFl两组。邸病毒编码的miRNAs可能通过调控邸病毒本 身编码的基因或者宿主细胞内的基因，从而参与了邸V介导的鼻咽上皮恶性转化，影响鼻 咽癌的发生发展。然而鼻咽癌中对于邸V编码miRNAs的研究还不是很透彻，44个成熟 的邸VmiRNAs中大部分还没有功能研究的报道，比如有关邸V-miR-BARTlO的作用及机制 的研究就很少。迄今为止有关邸V-miR-BARTlO与鼻咽癌发生发展中的作用的关系及其 在鼻咽癌病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。我们通过研 究表明，EBV-miR-BARTlO在鼻咽癌组织中的表达显著升高，高表达邸V-miR-BARTlO的鼻 咽癌患者比低表达邸V-miR-BARTlO的鼻咽癌患者更容易发生复发和转移，预后更差，因 此，针对邸V-miR-BARTlO设计专用原位杂交探针及检测试剂盒，用于检测鼻咽癌组织中 EBV-miR-BARTlO的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转移的预测提供参考。此 夕F，并非所有的邸VmiRNAs高表达时更容易发生复发和转移，预后更差，即成正相关；申 请人同时研究了多种其它邸VmiRNAs的表达与复发和转移的关系，例如：EBER-1在正常 鼻咽上皮中不表达或低表达，而在鼻咽癌组织中表达上调，但鼻咽癌组织中高表达邸ER-I 的患者比低表达邸ER-I的患者不容易发生复发和转移，预后更好，即成负相关。说明邸V miRNAs的表达与复发和转移的关系，不能推测。
[0005] 我们在鼻咽癌细胞中转染人工合成的邸V-miR-BARTlO,证实在邸V阴性的鼻咽 癌细胞株中过表达邸V-miR-BARTlO可W促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并合成祀 向邸V-miR-BARTlO的反义寡核巧酸，证实反义寡核巧酸可W有效抑制邸V-miR-BARTlO的 表达，并可W抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力；将邸V-miR-BARTlO的反义寡核巧酸负载 到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒可 保护邸V-miR-BARTlO的反义寡核巧酸免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效 率。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂提供新的途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种邸病毒编码的邸V-miR-BARTlO反义寡核巧酸的应用 方法，具体设及邸V-miR-BARTlO反义寡核巧酸在防治鼻咽癌的复发和转移的制剂中的应 用。
[0007] 邸病毒编码的microRNABARTlO反义寡核巧酸的应用方法，用于制备防治鼻咽 癌的复发和转移的制剂；所述的反义寡核巧酸的序列是ACAGCCAACUCCAUGGUUAUGUA(SEQ NO. 1)O
[0008] 所述的邸V-miR-BARTlO的序列：UACAUAACCAUGGAGUUGGCUGU(SEQNO. 2)。
[0009] 所述的制剂是将邸V-miR-BARTlO的反义寡核巧酸负载到多聚赖氨酸修饰的娃纳 米颗粒上制成纳米球。
[0010] 多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒是运用0P-10、环己烧、氨水的微乳液自组装技术进 行娃纳米颗粒的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修 饰，制备得到。
[0011] 制备多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒的过程：
[0012] 1)将0P-10、环己烧和氨水混合，室溫揽拌均匀后加入正娃酸异醋，继续揽拌至聚 合完成，加入等体积丙酬，超声分散，离屯、，双蒸水洗涂=次，离屯、收集沉淀于80°C干燥，研 细得粒径范围10-50皿的娃纳米颗粒；其中电0与OP-IO及&0与正娃酸异醋的摩尔比为 2~10、氨水浓度为1. 6~28%、正娃酸异醋在环己烧中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L; [001引。将娃纳米颗粒按0. 1~lOmg/ml重悬于0. 6M化C03溶液中，超声分散，离心弃 上清，再将沉淀物按0. 1~lOmg/ml重悬于抑7. 4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终 浓度为4~15nmol/mL，充分混匀，室溫混摇；离屯、，弃上清，沉淀按0. 1~lOmg/ml重悬于 双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒。
[0014] 将多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10~ 50U姐BV-miR-BARTlO反义寡核巧酸，混合，室溫静置使其结合。
[0015] 本发明所述的反义寡核巧酸可W有效地与邸V-miR-BARTlO成熟序列结合，阻 断邸V-miR-BARTlO的表达及其相应的调控作用，从而抑制鼻咽癌细胞的侵袭和转移。通 过研究证实邸V-miR-BARTlO在鼻咽癌组织中表达上调，高表达邸V-miR-BARTlO的鼻咽 癌患者比低表达邸V-miR-BARTlO的鼻咽癌患者更容易发生复发和转移，预后更差，因此EBV-miR-BARTlO的反义寡核巧酸有望进一步应用于防治鼻咽癌的复发和转移。体现本发明 所述用途的药物，可W保护反义寡核巧酸免受核酸酶降解，延长作用时间，有更高的转染效 率，有利于进一步的开发和应用。
【附图说明】
[0016] 图1为实时巧光定量PCR技术检测邸V-miR-BARTlO在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中 的表达情况；
[0017] EBV-miR-BARTlO在鼻咽癌灯）中的表达比正常鼻咽上皮（脚中显著提高。
[0018] 图2为原位杂交检测邸V-miR-BARTlO在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0019] 正常鼻咽上皮（NP巧中邸V-miR-BARTlO表达基本检测不到（negative)，而在106 例鼻咽癌（NPC)中39例检测到有邸V-miR-BARTlO的低表达化OW)，其余67例为高表达 Oii曲），P<0. 001。
[0020] 图3为邸V-miR-BARTlO的表达水平与鼻咽癌转移的相关性；
[0021] 在鼻咽癌组织中检测到邸V-miR-BARTlO的表达水平与鼻咽癌患者的淋己结转移 (左图，NO为没有淋己结转移，Nl~3为淋己结转移临床分级）及远处转移（右图，inSitu relapse:原位复发，Metastasis:远处转移）呈正相关关系。
[002引 图4为鼻咽癌中邸V-miR-BARTlO的表达与鼻咽癌患者预后的关系 [002引鼻咽癌中邸V-miR-BARTlO的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，即 EBV-miR-BARTlO高表达化i曲）的患者生存时间要明显短于邸V-miR-BARTlO低表达化OW) 的患者。
[0024] 图5为在邸V阴性的鼻咽癌细胞H肥2中导入邸V-miR-BART10寡核巧酸序列， EBV-miR-BARTlO在鼻咽癌细胞中的表达显著升高。
[002引在邸V阴性的鼻咽癌细胞系H肥2中导入邸V-miR-BARTlO寡核巧酸序列 度ART10)后，实时巧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中邸V-miR-BARTlO的表达情况， EBV-miR-BARTlO的表达显著升高。阴性对照（NC)为导入scramble序列。
[0026] 图6为在邸V阴性的鼻咽癌细胞H肥2中导入邸V-miR-BARTlO寡核巧酸序列后细 胞的侵袭能力提高，
[0027] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在邸V阴性的鼻咽癌细胞H肥2中导入 EBV-miR-BARTlO寡核巧酸序列，人为促进邸V-miR-BARTlO的表达后，能穿过基质胶膜的鼻 咽癌细胞数目显著增加，表明细胞侵袭能力增强，阴性对照（NC)为导入scr