L蛋白腺、0. 2g/L酵母提取物、0. 5g/L K2HP04、0. 5g/LNaCl和 0.Ig/LMgS〇4? 7&0,且要在 110°C灭菌 15min。
[0034] (3)黄杆菌菌株发酵培养：按2%接种量将步骤（2)的种子液接种于盛有50ml发 酵培养基的250ml S角瓶中，发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、0. 5g/L蛋 白腺、0. 2g/L酵母提取物、0. 5g/L馬册〇4,0. 5g/L化C1、0.1 g/L M拆〇4?7&0。在发酵0小 时时将无菌的诱导物质1，4-二径基-2-糞甲酸一次性添加入培养基，即在接种黄杆菌的发 酵培养时直接添加诱导物质，使发酵培养基中前体物质1，4-二径基-2-糞甲酸的浓度分别 为0mg/l、2. 5mg/l、5mg/l、lOmg/L、15mg/L和20mg/L，然后在25°C，100巧m振荡培养5天。 W上发酵过程最好为分批补料式发酵。
[0035] 发酵培养结束后取一定体积发酵液，离屯、得到菌体，冷冻干燥，W0. 2~0. 5倍于 原发酵液体积的甲醇浸泡菌体抽提过夜，或加甲醇浸泡经超声破碎处理10~30min后，再 高速离屯、收集抽提液。为了获得菌体干重进而计算出菌体生物量，可将一定体积离屯、得到 的菌体置于烘箱烘干至恒重后称重。
[0036] 利用高效液相色谱分析得到抽提液中维生素Kz浓度，进而计算出发酵液中维生素 Kz含量。测试在规格为200mmX4. 60mm，5ym的分析色谱柱0DS-C18柱的高效液相色谱仪 上进行，流动相为甲醇-二氯甲烧缓冲液，v/v= 4:1，流速1.Oml/min，检测波长为248皿。 实验中W未添加诱导物质的发酵培养为对照，考察了发酵起始添加诱导物质浓度对菌体生 长和MK产量的影响。
[0037] 图Ia为菌体生物量、MK产量和MK产量对菌体干重比随畑NA添加浓度增加的变 化曲线。由图可W看出，当DHNA浓度达到15mg/L时，黄杆菌菌体生物量（即菌体干重）下 降了，MK产量（包括MK4和MK6)也下降，但MK产量对菌体干重比（即MK产量对菌体干重 比）提高了，与对照组相比提高了 56.2%。 阳0測 实施例2
[0039] (1)黄杆菌菌株菌种活化：从冻存甘油管中挑取一环菌液采用稀释涂板法涂板于 含固体培养基的平板上，优选采纳稀释涂板法将菌液涂板，在37°C下倒置培养4她，挑取单 菌落接种至含固体培养基的新鲜斜面上，继续保持溫度倒置培养30h，其固体培养基的成分 包括40g/L麦芽糖、40g/L玉米浆、lOg/L蛋白腺、2g/L酵母提取物、5g/L馬册〇4、5g/L化Cl、 0. 5g/LM拆〇4? 7&0 和 20g/L琼脂粉。
[0040] (2)黄杆菌菌株种子培养：挑取生长成熟的斜面用接种环刮取一环菌苔接种于盛 有100mL种子培养基的500mlS角瓶中，在37°C，200巧m振荡培养3化制得种子液，上述 种子培养基的成分包括40g/L麦芽糖、40g/L玉米浆、lOg/L蛋白腺、2g/L酵母提取物、5g/L 馬册〇4、5邑/1化Cl和0. 5g/LM拆〇4? 7&0,且要在130°C灭菌30min。
[0041] (3)黄杆菌菌株发酵培养：按10%接种量将步骤（2)的种子液接种于盛有100mL 发酵培养基的250ml S角瓶中，发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、lOg/L蛋 白腺、2g/L酵母提取物、5g/L K2HP〇4、5g/L化Cl和0. 5g/L M拆〇4-7&0。在发酵0小时时 将无菌的诱导物质VKs-次性添加入培养基，即在接种黄杆菌的发酵培养时直接添加诱导 物质，使发酵培养基中前体类似物VKsf亚硫酸氨钢甲糞酿）的浓度分别为0mg/l、2. 5mg/l、 5mg/L、lOmg/l、15mg/L和20mg/L，然后在25°C，100巧m振荡培养5天。
[0042] 发酵培养结束后取一定体积发酵液，离屯、得到菌体，冷冻干燥，W0. 2~0. 5倍于 原发酵液体积的甲醇浸泡菌体抽提过夜，或加甲醇浸泡经超声破碎处理10~30min后，再 高速离屯、收集抽提液。为了获得菌体干重进而计算出菌体生物量，可将一定体积离屯、得到 的菌体置于烘箱烘干至恒重后称重。利用高效液相色谱分析得到抽提液中MK浓度（测试 条件同实施例1)，进而计算出发酵液中MK含量。
[0043] 图化为菌体生物量、MK产量和MK产量对菌体干重比随VKs添加浓度增加的变化 曲线。测试结果表明，当VKs浓度达到15mg/L时，黄杆菌菌体生物量（即菌体干重）下降 了，MK产量（包括MK4和MK6)也下降，但MK产量对菌体干重比（即MK产量对菌体干重比） 提高了，与对照组相比提高了57. 9%。
[0044] 实施例3 W45] (1)黄杆菌菌株菌种活化：从冻存甘油管中挑取一环菌液于含固体培养基的平板 上，优选采纳稀释涂板法将菌液涂板，在37°C下倒置培养4她，挑取单菌落接种至含固体培 养基的新鲜斜面上，继续保持溫度倒置培养30h，其固体培养基的成分包括40g/L麦芽糖、 40g/L玉米浆、lOg/L蛋白腺、2g/L酵母提取物、5g/LK2HP〇4、5g/L化C1、0. 5g/LM拆〇4'7&0 和20g/L琼脂粉。
[0046] (2)黄杆菌菌株种子培养：挑取生长成熟的斜面用接种环刮取一环菌苔接种于盛 有100mL种子培养基的500mlS角瓶中，在37°C，200巧m振荡培养3化制得种子液，上述 种子培养基的成分包括40g/L麦芽糖、40g/L玉米浆、lOg/L蛋白腺、2g/L酵母提取物、5g/L 馬册〇4、5邑/1化Cl和0. 5g/LM拆〇4? 7&0,且要在130°C灭菌30min。
[0047] (3)黄杆菌菌株发酵培养：按10%接种量将步骤（2)的种子液接种于盛有100mL 发酵培养基的250ml S角瓶中，发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、lOg/L蛋 白腺、2g/L酵母提取物、5g/L K2HP〇4、5g/L化Cl和0. 5g/L M拆〇4'7&0。在发酵0小时时将 无菌的诱导物质异戊締醇（YWXC) -次性添加入培养基，即在接种黄杆菌的发酵培养时直 接添加诱导物质，使发酵培养基中前体类似物异戊締醇灯WXC)的浓度分别为Omg/l、IOmg/ 1^、25111旨/1^、5〇111旨/1^、75111旨/1^和10〇111旨/1^，然后在25°[，100巧1]1振荡培养7天。
[0048] 发酵培养结束后取一定体积发酵液，离屯、得到菌体，冷冻干燥，W0. 2~0. 5倍于 原发酵液体积的甲醇浸泡菌体抽提过夜，或加甲醇浸泡经超声破碎处理10~30min后，再 高速离屯、收集抽提液。为了获得菌体干重进而计算出菌体生物量，可将一定体积离屯、得到 的菌体置于烘箱烘干至恒重后称重。利用高效液相色谱分析得到抽提液中MK浓度（测试 条件同实施例1)，进而计算出发酵液中MK含量。
[0049] 实验结果如图Ic,当异戊締醇（YWXC)浓度达到75mg/L时，黄杆菌菌体生物量（即 菌体干重）下降了，MK产量（包括MK4和MK6)也下降，但MK产量对菌体干重比（即MK产 量对菌体干重比）提高了，与对照组相比提高了 23.0%。
[0050] 实施例4
[0051] (I)黄杆菌菌株菌种活化：从冻存甘油管中挑取一环菌液采用稀释涂板法涂板于 含固体培养基的平板上，优选采纳稀释涂板法将菌液涂板，在3rc下倒置培养36h，挑取单 菌落接种至含固体培养基的新鲜斜面上，继续保持溫度倒置培养25h，其固体培养基的成分 包括25g/L麦芽糖、25g/L玉米浆、5. 3g/L蛋白腺、1.Ig/L酵母提取物、2. 7g/L馬册〇4、2. 7g/ L化C1、0. 3g/LM拆〇4? 7&0 和 17. 5g/L琼脂粉。
[0052] (2)黄杆菌菌株种子培养：挑取生长成熟的斜面用接种环刮取一环菌苔接种于盛 有75ml种子培养基的500ml=角瓶中，在31°C，ISOrpm振荡培养2化制得种子液，上述种子 培养基的成分包括25g/L麦芽糖、25g/L玉米浆、5. 3g/L蛋白腺、1.Ig/L酵母提取物、2.Sg/ LK2HPO4J.8g/L化Cl和 0. 3g/LM拆〇4? 7&0,且要在 120°C灭菌 23min。
[005引 做黄杆菌菌株发酵培养：按6%接种量将步骤似的种子液接种于盛有75ml发 酵培养基的250mlS角瓶中，发酵培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、5. 3g/L蛋 白腺、1.Ig/L酵母提取物、2.8g/LK2HPO4J.8g/L化Cl和 0. 3g/LM拆04? 7&0。在发酵 72 小时时将无菌的诱导物质VKsSOmg/L-次性添加入培养基，然后在31°C，150巧m振荡培养6 天。
[0054] 发酵培养结束后取一定体积发酵液，离屯、得到菌体，冷冻干燥，W0. 2~0. 5倍于 原发酵液体积的甲醇浸泡菌体抽提过夜，或加甲醇浸泡经超声破碎处理10~30min后，再 高速离屯、收集抽提液。为了获得菌体干重进而计算出菌体生物量，可将一定体积离屯、得到 的菌体置于烘箱烘干至恒重后称重。利用高效液相色谱分析得到抽提液中MK浓度（测试 条件同实施例1)，进而计算出发酵液中MK含量。
[0055] 实验结果如图2,由图可知，维生素Kz含量与对照组相比提高了 17. 1%，维生素Kz 产量对菌体干重比与对照组相比提高了21.2%。
[0056] 实施例5
[0057] 黄杆菌菌株种子培养的种子培养基成分包括30g/L麦芽糖、20g/L玉米浆、lOg/L 蛋白腺、1. 5g/L酵母提取