结合到rsv g蛋白的人类抗体的制作方法
【专利说明】结合到RSVG蛋白的人类抗体 发明领域
[0001] 本发明设及医学。本发明尤其设及特异性结合到呼吸道合胞体病毒巧SV)的附着 糖蛋白（G蛋白）并且中和RSV的抗体和抗原结合片段。本发明还设及使用抗RSV抗体的 诊断、预防W及治疗方法。 阳00引发明背景
[0003] 人类呼吸道合胞体病毒巧SV)是副粘病毒科（Paramyxoviridae)的一种负义单链 RNA病毒，该科还包括常见呼吸道病毒，如导致麻疹和腮腺炎的呼吸道病毒。存在两种原始 RSV亚型：亚型A和亚型B。RSV在上呼吸道中复制并且然后蔓延到下气道，导致细支气管 炎或肺炎。该病毒引起炎症、气道水肿、粘液产生增加W及呼吸上皮破裂。
[0004] 估计全世界有6400万例呼吸道疾病和160, 000例死亡可归因于RSV诱发的疾病。 严重RSV感染最通常出现在儿童和婴儿中、尤其早产儿中。潜在健康问题（如慢性肺病或 先天性屯、脏病）可能会显著增加重病的风险。RSV感染还可能会在年老者、患有慢性肺病的 个体W及免疫功能不全的成人（如骨髓移植接受者）中引起重病。 阳0化]已经研究若干用W预防和治疗RSV感染的方法。从供体分离的静脉注射免疫球蛋 白巧SV-IGIV;Resp沿am⑧）和单克隆抗体帕利珠单抗（SYNA创沪'）已经得到批准用 于在高风险早产儿中进行RSV预防。然而，用于RSV的疫苗或可商购治疗仍不可获得。仅 利己韦林（一种RNA抑制剂）得到批准用于治疗RSV感染。为了有效用于治疗RSV感染， 高剂量、重复给药和/或大量的抗体产品（如帕利珠单抗）因低有效性而是所需的。
[0006] RSV具有两种主要表面糖蛋白，F和G。F蛋白介导融合，使得病毒进入到细胞 的细胞质中并且促进体外合胞体的形成。F蛋白序列在RSV株之中是充分（约90% ) 保守的（约翰逊（Johnson)和柯林斯（Collins),《普通病毒学杂志》（JGenVirol), (1988)69:2623-2628)。唯一市售的单克隆抗体帕利珠单抗针对RSV的F蛋白。
[0007] RSV的G蛋白是一种严重糖基化并且充当附着蛋白的表面蛋白。与F蛋白对比，G 蛋白在病毒株中除中央保守域（CCD)外相当可变，该中央保守域包含RSVA2株的G蛋白的 氨基酸残基153-184或其他病毒株中的相对应的氨基酸残基。中央保守域和相邻区（残基 145-193)W刚性和重0-糖基化粘蛋白样区为边界。中央保守域的N末端那一半含有一个 在多于700种病毒株之中保守的小区。C末端那一半含有4个W1-4、2-3布局连接的保守 半脫氨酸并且折叠为一个脫氨酸套索。
[0008] 尽管使用针对G蛋白的抗体进行的被动免疫一般由于在病毒株中缺乏序列保 守性而被视为不切实际的，但中和结合到RSVG蛋白的单克隆抗体是已知的。安德森 L.J. (Anderson,L.J.)等人（《病毒学杂志》（J.Virol.) (1988)62:4232-4238)描述了F和 G鼠类单克隆抗体混合物的中和能力，运些抗体之一结合到RSVG蛋白（即131-2G)。运种 抗体的抗原位点后来由萨伦德（Sullender)定义（《病毒学》(Virol.) (1995)209:70-79)。 发现运种抗体结合代表RSV的主要病毒株的RSV组A和B。另外，WO2009/055711披露了 与RSVA2的G蛋白内的保守基元具有免疫反应性并且针对RSVA和B亚型具有中和活性 的抗体，如3D3和3G12。运些抗体已经显示识别中央保守域中的线性表位，但尚未在优选动 物模型（即棉花大鼠）中进行测试用于评估RSV抗体和疫苗。
[0009] 鉴于特别是在幼儿和年老者中由RSV引起的呼吸道疾病的严重程度，持续需要用 W预防和治疗RSV感染的有效手段。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供了特异性结合到RSVG蛋白并且能够中和RSV的分离的抗体和其抗原 结合片段。运些抗体和抗原结合片段优选地能够特异性结合到并且中和亚型A和B的RSV。 优选地，运些抗体是人类抗体。运些抗体结合到该RSVG蛋白的中央保守未糖基化区（也 称为中央保守域，CCD)中的表位。
[0012] 运些抗体和抗原结合片段对于该G蛋白具有高亲和力并且具有有力的中和能力。 运些本发明的抗体和抗原结合片段单独和与其他诊断、预防和/或治疗剂组合可用作诊 断、预防和/或治疗剂。
[0013] 本发明进一步提供了组合物，运些组合物包含一种或多种本发明的抗体和/或其 抗原结合片段。本发明还提供了使用运些抗RSV抗体的诊断、预防W及治疗方法。预防和 治疗方法包括将运些抗RSV抗体和/或其抗原结合片段给予人类受试者用于预防或治疗一 种RSV感染和RSV介导的疾病或病状和/或改善一种RSV感染的一种或多种症状。多种不 同抗RSV抗体和/或其抗原结合片段和/或与其他抗RSV抗体的组合可W用于组合疗法。 还提供了包含运些抗RSV抗体和/或其抗原结合片段与其他预防或治疗剂组合的组合物。 本发明还提供了编码运些抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
[0014] 运些本发明的抗体是独特的，在于至少在一种体外中和分析中，针对RSVA和B型 运些抗体比任何已知抗RSVG抗体、特别是比已知抗RSVG单克隆抗体3D3更有力。
[0015] 运些本发明的抗体结合到该RSVG蛋白上的独特表位。
[0016] 在某些实施例中，运些抗体包含一个在其氨基酸序列中包含一种CXXXXC基元的 重链CDR3。
[0017] 在某些实施例中，运些抗体和其抗原结合片段是独特的，在于它们与抗RSVF抗体 叠加和/或协同地起作用。
【附图说明】
[0018] 凰I示出了针对RSVGa和RSV抓蛋白的结合特征曲线。在化ISA分析中测试 IgG结合到重组RSVGa和Gb蛋白的胞外域的能力。开口圈（虚线）表示结合到Ga巧SVA/ 长）并且闭口圈（实线）表示结合到Gb巧SVB/B1)。
[0019] 图2示出了针对RSV-A和RSV-B株的中和特征曲线。在中和分析中测试IgG中和 RSV-A和RSV-B株的能力。开口圈（虚线）表示中和RSV-A巧SVA/A2)并且闭口圈（实线） 表示中和RSV-B巧SVB/18537)。
[0020] Ml示出了RSVG特异性单克隆抗体与RSVG肤的结合巧LISA)。跨越中央保守 域的短和长RSVG肤（表15)在一种化ISA中用于结合实验，其中RSVG特异性mAb的浓 度不同：CB003. 1 (闭口黑色圈，实线）、CB010. 7 (开口黑色圈，虚线），或无单克隆抗体（闭 口浅灰色圈）。
[0021] 图4 :通过化DScan讲行的最小表仿定仿。RSVG蛋白特异性抗体与中央区巧SV-G A型和B型的残基145-201)的所有完全重叠5聚体（mer)、8聚体、10聚体、14聚体、18聚 体、25聚体W及32聚体肤的结合活性。与一种肤的结合活性W与化pScanELISA信号成比 例的垂直线形式示出。
[0022] 图5 :通讨P巧Scan进行的CB003. 1和CB010. 7表位的完全取代分析。单克隆 抗体CB003. 1和CB010. 7对应地在100和30ng/mL下与一种肤的结合活性W与化pscan ELISA信号成比例的垂直线形式示出。具有20条线的每一组对应于针对初始14聚体肤 (FHFEVFNFVPCSIC)中的每个氨基酸位置设定的完全置换。在每一组的20条线内，取代是基 于单字母氨基酸代码按字母顺序的（ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY)并且初始14聚体肤的反应性 W灰色条形式示出。
[0023]图6:RSVG蛋白中央区的丙氨酸扫描（P巧Scan)。对应于A型（左图）和B型（右 图）的RSV-G中央域的残基161-192的肤的所有位置处的丙氨酸取代。A型的位置180处 的丙氨酸被甘氨酸取代。初始肤的反应性W灰色条形式示出。
[0024] Ml示出了单克隆抗体与RSV G蛋白中央区的天然存在的变体的结合。mAb CB003. 1和CB010. 7与对应于可用的A型（上图）和B型（下图）变体的不同肤的结合。 野生型肤的反应性W灰色条形式示出。 阳0巧]图8示出了抗RSVGmAb在激发后第4天在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于肺和 鼻甲病毒负荷的预防功效。 阳0%] 图9示出了抗RSVGmAb在激发后第4天在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于肺和 鼻甲病毒负荷的治疗功效。
[0027]图10示出了在激发后第6天抗RSVGmAb在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于组织 病理学分数的治疗功效。 阳0測发明说明
[0029] 定女
[0030]W下给出如本发明中所用的术语的定义。
[00川如在此所用，术语"包括（included)"或"包括着（including)"被视为后面有措 辞"无限制"。
[0032] 如在此所用，术语"抗体"是指免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体，如嵌合、人类化 或人类单克隆抗体。术语"抗体"包括本领域中已知的所有免疫球蛋白类别和子类。取决 于其重链的恒定域的氨基酸序列，抗体可W被分成五种主要完整抗体类别：IgA、I曲、I姐、 IgGW及IgM，并且运些类别中的数种可W进一步被分成子类（同种型），例如IgAl、IgA2、 IgGl、IgG2、IgG3W及IgG4。
[0033] 术语抗原结合片段是指一种免疫球蛋白的包含抗原结合和/或可变域的片段，运 些片段与完整免疫球蛋白为特异性结合到免疫球蛋白（即RSVG蛋白）的结合伴侣而竞 争。无关于结构，抗原结合片段与由完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。抗原结合片段 尤其包括F油、F(油'）、F(油'）2、Fv、dAb、Ft互补决定区（CDR)片段、单链抗体（scFv)、 二价单链抗体、（单）域抗体、双功能抗体、=功能抗体、四功能抗体、至少含有一种免疫球 蛋白的足W致使特异性抗原结合到（多）肤的一个片段的（多）肤等。一种抗原结合片 段可W包含包括抗体的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基的一种氨基酸序列的一种肤或多肤。抗原 结合片段可W合成地或通过使完整免疫球蛋白酶促或化学裂解而产生，或它们可W通过重 组DM技术而基因工程化。产生方法在本领域中是熟知的并且在例如《抗体：实验手册》 (Antibodies:AL油oratoryManual)，E.哈洛化Harlow)和D莱恩值,Lane)编（1988)， 冷泉港实验室（ColdSpring化rborL油oratory),冷泉港（ColdSpring化rbor)，纽约 (NewYork)中进行描述，该文献通过引用结合在此。一种抗体或其抗原结合片段可W具有 一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，那么运些结合位点可W与彼此相同或 它们可W是不同的。
[0034] 如在此所用，术语"克隆抗体"是指具有单一特异性的抗体分子。一种单克隆抗体 对于一种具体表位呈现一种单一结合特异性和亲和力。因此，术语"人类单克隆抗体"是指 一种呈现一种单一结合特异性的抗体，该抗体具有衍生自或基于人类生殖系免疫球蛋白序 列或衍生自完全合成序列的可变和恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性不相关。
[0035] 如在此所用，术语"功能变体"是指一种抗体，该抗体包含与一种参考抗体的核巧 酸和/或氨基酸序列相比通过一个或多个核巧酸和/或氨基酸而改变的一种核巧酸和/或 氨基酸序列并且能够与参考抗体为特异性结合到结合伴侣（即RSV)而竞争。换句话说，参 考抗体的氨基酸和/或核巧酸序列中的修饰不显著影响或改变由该核巧酸序列编码或含 有该氨基酸序列的抗体的结合特征，即该抗体仍能够特异性识别并且结合其标祀。功能变 体可W具有保守序列修饰，包括核巧酸和氨基酸取代、添加W及缺失。运些修饰可W通过本 领域中已知的标准技术（如定点诱变和随机PCR介导的诱变）引入，并且可W包含天然W 及非天然核巧酸和氨基酸。
[0036] 如在此关于本发明的抗体所用，术语"中和"是指能够通过中和或抑制其生物效应 和/或降低RSV的感染滴度而防止或抑制一种细胞受病毒感染的抗体，无关于实现中和的 机制。中和可W例如通过抑制病毒与细胞表面的附着或粘着或通过抑制病毒与细胞膜在病 毒与标祀细胞附着之后的融合等来实现。
[0037] 如在此关于一种抗体与其结合伴侣（例如一种抗原）的相互作用所用，术语"特异 性结合"意指相互作用取决于该结合伴侣上一种具体结构（例如一种抗原決定子或表位） 的存在。换句话说，即使当该结合伴侣存在于其他分子或生物体的混合物中时，该抗体也优 先结合或识别该结合伴侣。结合可W由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。又换句 话说，术语"特异性结合"意指该抗体与一种抗原決定子或表位具有特异性免疫反应性并且 与其他抗原決定子或表位不具有免疫反应性。（免疫）特异性结合到一种抗原的一种抗体 可W按较低亲和力结合到其他肤或多肤，如通过例如放射免疫分析巧IA)、酶联免疫吸附分 析巧LISA)、BIAC0RE或本领域中已知的其他分析测定。特异性结合到一种抗原的抗体或其 片段可W与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。优选地，特异性结合到一种抗原的 抗体或其片段与其他抗原不交叉反应。
[0038] 发巧详细说巧
[0039] 在一个第一方面，本发明提供了能够特异性结合到呼吸道合胞体病毒巧SV)的G 蛋白并且能够中和RSV的抗体和抗原结合片段。运些抗体优选地能够特异性结合到并且中 和亚型