改善的tnf结合蛋白的制作方法
【专利说明】改善的TNF结合蛋白
[OOCM] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请系列号U.S. 61/788, 113的优 先权，其通过引用W其整体并入本文。
[0003] 该申请也涉及2013年1月22日提交的美国临时申请系列号61/755, 288,2012年 12月28日提交的美国临时申请系列号61/746, 616,和2012年12月28日提交的美国临时 申请系列号61/746, 617,其每一篇通过引用W它们的整体并入本文。
[0004] 背景
[0005] 治疗性组织坏死因子a(TNFa)结合蛋白的使用，比如英夫利昔单抗、阿达木单 抗、依郝西普、戈利木单抗和赛巧珠单抗已经彻底改革了许多慢性炎性疾病，包括炎性肠炎 (IBD)、强直性脊柱炎、多发性硬化、牛皮癖和风湿性关节炎（RA)的治疗。尽管它们成功改 善了患者的生命质量，但是用治疗性TNF结合蛋白的长期治疗引起强的免疫原性应答，其 使得产生抗药物抗体（ADA)。送样的ADA应答可影响治疗性TNF结合蛋白的安全性和药物 动力学，其接着可影响送些药物的用途和效力。因此，本领域需要新的TNF结合蛋白，用作 在患者中较少免疫原性的疗法。
【发明内容】
[0006] 本公开提供了新的TNF结合蛋白和使用其治疗的方法。也提供了编码结合蛋白的 核酸和制备送样的结合蛋白的重组表达载体和宿主细胞。本公开至少部分基于下述发现： 二价TNF结合蛋白（例如，抗TNF单克隆抗体）可结合抗原呈递细胞的细胞表面上的TNF 并且内化。本文公开的结合蛋白一般展示单价结合细胞-表面TNFa(即，每个结合蛋白仅 能够结合抗原呈递的表面上的一个TNF分子）。
[0007] 因此，在一个方面中，本公开提供特异性结合人TNF的结合蛋白，其中结合蛋白 包括抗体可变区和Fc区域，和其中和结合蛋白当结合细胞表面人TNF时展示的细胞内化的 数量小于抗人TNF参考抗体（例如，英夫利昔单抗，阿达木单抗，或戈利木单抗）展示的细 胞内化的数量。在某些实施方式中，结合蛋白单价结合抗原呈递细胞上的细胞表面人TNF。
[0008] 在某些实施方式中，结合蛋白包括第一多肤链和第二多肤链，
[0009] 其中第一多肤链包括VDH-狂1)n-C-Y1，其中
[0010] VDH是重链可变区，
[0011] XI是连接体，条件是其不是CH1，
[001引C是CH1结构域，
[001引Y1是Fc区域，
[0014]n是0或 1;
[001引 和
[0016] 其中第二多肤链包括VDka3)m-C，其中
[0017] VDL是轻链可变区，
[0018] X3是连接体，条件是其不是CH1,
[001引C是化1，
[0020] m是 0 或 1 ;
[0021] 其中X2包括抑制Y1的同源二聚化的至少一个突变。在一个具体的实施方式中， Y1包括选自表3中提出的组的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，XI和/或X3包括 表1中提出的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDH包括英夫利昔单抗、阿达木单 抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的重链CDR或全部的VH结构域氨基酸序列。在一个具体 的实施方式中，VDL包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的轻链 CDR或全部的化结构域氨基酸序列。
[0022] 在某些实施方式中，结合蛋白包括第一多肤链和第二多肤链，其中第一多肤链包 括VDH1-狂1)n-VD肥-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0023]V畑1是第一重链可变区；
[0024]XI是连接体，条件是XI不是CH1;
[0025]V畑2是第二重链可变区；
[0026]X2 是CH1;
[0027]X3是连接体；
[0028]Y1 是Fc区域；
[0029]n是0 或l，m是0 或 1;
[0030]和
[0031] 其中第二多肤链包括VDL1-狂4)m-VDL2-X5,其中：
[0032]VDL1是第一轻链可变区；
[003引X4是连接体，条件是X4不是CH1;
[0034]VDL2是第二轻链可变区；
[0035]X5 是化1;
[0036]m是 0 或 1，
[0037] 其中Y1包括抑制Y1的同源二聚化的至少一个突变。在一个具体的实施方式中， XI、X2和/或X4包括表1中提出的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，Y1包括表3中 提出的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDH1和/或VDH2包括英夫利昔单抗、阿达 木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的重链CDR或全部的VH结构域氨基酸序列。在一个 具体的实施方式中，VDL1和/或VDL2包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或 戈利木单抗的轻链CDR或全部的化结构域氨基酸序列。
[0038] 在某些实施方式中，结合蛋白包括四条多肤链，
[0039] 其中所述四条多肤链的两条包括VDH-狂l)n-C-Yl，其中
[0040]VDH是重链可变区，
[0041]XI是连接体，条件是其不是CH1，
[004引C是CH1结构域，
[0043]Y1 是Fc区域，
[0044] n是 0 或 1;
[0045]和
[0046]其中所述四条多肤链的两条包括VDk狂2)m-X3，其中
[0047]VDL是轻链可变区，
[0048]X2是连接体，条件是其不是CH1，
[004引X3是化结构域，
[0050]m是 0 或 1;
[0051] 其中所述四条多肤链的至少一条包括突变，所述突变位于可变区中，其中所述突 变抑制特定的抗原和突变体结合结构域之间的祀向结合。在一个具体的实施方式中，Y1包 括增强异源二聚化的突变。在一个具体的实施方式中，Y1包括表3中提出的氨基酸序列。 在一个具体的实施方式中，XI和/或X2包括表1提出的氨基酸序列。在一个具体的实施 方式中，VDH包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的重链CDR或 全部的VH结构域氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDL包括英夫利昔单抗、阿达木 单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的轻链CDR或全部的VL结构域氨基酸序列。
[0052] 在某些实施方式中，结合蛋白包括四条多肤链，
[0053] 其中所述四条多肤链的两条包括V畑1-狂l)n-VD肥-C-Y1，其中
[0054]V畑1是第一重链可变区，
[0055]V畑2是第二重链可变区，
[0056] C是重链恒定结构域，
[0057] XI是连接体，条件是其不是CH1，
[0058]Y1 是Fc区域，
[0059]n是 0 或 1;
[0060]和
[0061] 其中所述四条多肤链的两条包括VDL1-狂2)m-VDL2-X3,其中
[0062]VDL1是第一轻链可变区，
[0063]VDL2是第二轻链可变区，
[0064]X2是连接体，条件是其不是CH1，
[00财 X3是化结构域，
[0066]m是 0 或 1;
[0067] 其中所述四条多肤链的至少一条包括突变，所述突变位于第一可变区或第二可变 区中，其中所述突变抑制特定的抗原和突变体结合结构域之间的祀向结合。在一个具体的 实施方式中，突变位于VDH1和/或VD肥中。在一个具体的实施方式中，突变位于VDL1和 /或VDL2中。在一个具体的实施方式中，Y1包括增强异源二聚化的突变。在一个具体的实 施方式中，Y1包括表3中提出的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，XI和/或X2包 括和表1中提出的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDH1和/或VD肥包括英夫利 昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的重链CDR或全部的VH结构域氨基酸 序列。在一个具体的实施方式中，VDL1和/或VDL2包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化 赛巧珠单抗或戈利木单抗的轻链CDR或全部的VL结构域氨基酸序列。
[0068] 在某些实施方式中，结合蛋白包括第一多肤链和第二多肤链，所述第一多肤链包 括VDH-狂l)n-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0069] VDH是重链可变区；
[0070]XI是连接体，条件是XI不是CH1;
[0071]X2是CHI;
[007引X3是连接体；
[007引Y1是F区域；
[0074]n是0或l，m是0或1;
[00巧]并且所述第二多肤包括VDka4)n-X5-狂6)m-Y2,其中：
[0076] VDL是轻链可变区；
[0077] X4是连接体，条件是X4不是CH1;
[0078] X5是化1;
[007引X6是连接体；
[0080]Y2是F区域；
[008。n是0或l，m是0或1 ;其中Y1和Y2每个包括突变，其中Y1和Y2上的突变增强Y1和Y2之间的相互作用。在一个具体的实施方式中，Y1和/或Y2包括表3中提出的氨基 酸序列。在一个具体的实施方式中，XI，X3，X4,和/或X6包括和表1中提出的氨基酸序列。 在一个具体的实施方式中，VDH包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木 单抗的重链CDR或全部的VH结构域氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDL包括英夫 利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的轻链CDR或全部的化结构域氨基 酸序列。
[0082] 在某些实施方式中，结合蛋白包括第一多肤链和第二多肤链，所述第一多肤链包 括VDH1-狂1) n-VD肥-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0083] V畑1是第一重链可变区；
[0084] XI是连接体，条件是XI不是CH1;
[0085] V畑2是第二重链可变区；
[0086] X2是CH1;
[0087] X3是连接体；
[008引Y1是F区域；
[0089] n是0或l，m是0或1;
[0090] 并且所述第二多肤包括VDL1-狂4)n-VDL2-X5-狂6)m-Y2,其中：
[0091] VDL1是第一轻链可变区；
[009引X4是连接体，条件是X4不是CH1;
[0093] VDL2是第二轻链可变区；
[0094] X5是化1;
[009引X6是连接体；
[009引Y2是F区域；
[0097]n是0或1，m是0或1，其中Y1和Y2每个包括突变，其中Y1和Y2上的突变增强Y1和Y2之间的异源二聚化。在一个具体的实施方式中，Y1和/或Y2包括表3中提出的氨 基酸序列。在一个具体的实施方式中，XI和/或X3,包括和表1中提出的氨基酸序列。在 一个具体的实施方式中，VDH1和/或VD肥包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗 或戈利木单抗的重链CDR或全部的VH结构域氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，VDL1 和/或VDL2包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的轻链CDR或 全部的化结构域氨基酸序列。
[0098] 在某些实施方式中，结合蛋白包括第一、第二、第H和第四多肤链，
[0099] 其中所述第一多肤链包括VD1-狂l)n-VD2-CH-狂2)n，其中VD1是第一重链可变 区，VD2是第二重链可变区，C是CH1结构域，XI是连接体，条件是其不是恒定结构域，和X2 是化区域；
[0100] 其中所述第二多肤链包括VD1-狂l)n-VD2-a-狂2)n，其中VD1是第一轻链可变 区，VD2是第二轻链可变区，CL是轻链恒定结构域，XI是连接体，条件是其不是恒定结构域， 和X2不包括Fc区域；其中所述第H多肤链包括VD3-狂3)n-VD4-化-狂4)n，其中VD3是第 H重链可变区，VD4是第四重链可变区，化是轻链恒定结构域，X3是连接体，条件是其不是 恒定结构域，和X4是Fc区域；其中所述第四多肤链包括VD3-狂3)n-VD4-CH-狂4)n，其中 VD3是第H轻链可变区，VD4是第四轻链可变区，CH是CH1结构域，X3是连接体，条件是其 不是恒定结构域，和X4不包括Fc区域；其中n是0或1，和其中第一和第二多肤链上的VD1 结构域形成第一抗原的一个功能结合位点，第一和第二多肤链上的VD2结构域形成第二抗 原的一个功能结合位点，第H和第四多肤链上的VD3结构域形成一个第H抗原的功能结合 位点，和第H和第四多肤链上的VD4结构域形成第四抗原的一个功能结合位点。在一个具 体的实施方式中，第一、第二、第H或第四抗原的至少一个是人TNF。
[0101] 在一个具体的实施方式中，X2和/或X4包括增强X2和X4的异源二聚化的至少 一个突变。在一个具体的实施方式中，X2和/或X4包括表3中提出的氨基酸序列。在一 个具体的实施方式中，XI和/或X3,包括和表1中提出的氨基酸序列。在一个具体的实施 方式中，VD1、VD2、VD3和/或VD4包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利 木单抗的重链CDR、轻链CDR、全部的VH结构域，或全部的化结构域氨基酸序列。
[0102] 在某些实施方式中，结合蛋白包括多肤链，其中多肤链包括RD1-狂)n-VDH-C-Y或 VDH-狂)n-畑 1-C-Y，其中
[0103] 畑1包括受体的配体-结合结构域；
[0104] VDH是重链可变区；
[0105] C是重链恒定结构域；
[0106]X是连接体，条件是其不是CH1;
[0107]Y是Fc区域；和 [010引n是0或1。
[0109] 在一个具体的实施方式中，RD1包括结合人TNF的受体。在一个具体的实施方式 中，RD1包括依郝西普的TNF受体结合部分。在一个具体的实施方式中，VDH包括英夫利昔 单抗、阿达木单抗、培化赛巧珠单抗或戈利木单抗的重链CDR，或全部的VH结构域氨基酸序 列。
[0110] 在另一方面中，本公开提供了组合物，其包括前述权利要求任一项所述的结合多 肤和药学上可接受的载体或赋形剂。
[0111] 在另一方面中，本公开提供了在需要其的对象中治疗TNF相关不适的方法，包括 向对象施用有效量的本文公开的组合物。
[0112] 在另一方面中，本公开提供了编码本文公开的结合多肤的分离的多核巧酸。
[0113] 在另一方面中，本公开提供了包括本文公开的多核巧酸的载体。
[0114] 在另一方面中，本公开提供了包括本文公开的多核巧酸或载体的宿主细胞。
【附图说明】
[0115] 图1描绘了测量TNFa在LI^S刺激的外周血单核细胞上的表面表达实验的结果。
[0116] 图2描绘了测量TNFa在LI^S刺激的外周血单核细胞和T细胞上的表面表达实验 的结果。
[0117] 图3描绘了测量通过LPS刺激的外周血单核细胞抗TNFa抗体的内化的实验的结 果。
[0118] 图4描绘了测量在LPS处理的人单核细胞上TNFa表面表达的实验的结果。
[0119] 图5描绘了测量在GM-CSF和LI^S刺激的外周血单核细胞上TNFa的表面表达的 实验的结果。
[0120] 图6描绘了测量LPS刺激的细胞上TNFa表面表达的实验的结果。
[0121] 图7描绘了测量TNFa在LI^S刺激的源自人单核细胞的树突细胞表面表达的实验 的结果。
[0122] 图8描绘了测量抗TNFa抗体通过LI^S刺激的源自单核细胞的树突细胞的内化实 验的结果。
[0123] 图9描绘了测量通过LI^S刺激的外周血单核细胞的抗TNFa抗体的内化动力学的 实验的结果。
[0124] 图10描绘了如本文公开的示例性半体单价抗TNF抗体和DVD-Ig分子。
[0125] 图11描绘了如本文公开的示例性AbbmAb单价抗TNF抗体或DVD-Ig分子。
[0126] 图12描绘了如本文公开的示例性单价免疫球蛋白（M体）分子。
[0127] 图13描绘了如本文公开的示例性多可变、单价抗TNF多Ig分子。
[012引发明详述
[0129] 本公开提供了新的TNF结合蛋白和使用其治疗的方法。也提供了编码结合蛋白的 核酸和制备送样的结合蛋白的重组表达载体和宿主细胞。本公开至少部分基于下述发现： 二价TNF结合蛋白（例如，抗TNF单克隆抗体）可结合抗原呈递细胞的细胞表面上的TNF 并且内化。就细胞表面TNF结合而言，本文公开的结合蛋白一般是单价的（即，每个结合蛋 白仅能够结合抗原呈递的表面上的一个TNF分子）。 阳130] I.定父
[0131] 除非本文另外定义，结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通 常理解的意思。术语的意思和范围应是清楚的，但是，万一任何潜在的不清楚的情况下，W 本文提供的定义为准，而不考虑任何词典或外部定义。此外，除非上下文另外需要，单数术 语应包括多个并且复数术语应包括单数。一般而言，本文描述的结合细胞和组织培养、分子 生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名，和技术是现有 技术熟知和常用的郝些。
[0132] 为了本发明可更容易理解，首次定义了某些术语。
[0133] 如本文所使用，术语"单体（monobody)DVD"或"血VD"指单价DVD-Ig分子，如美 国临时申请系列号61/755, 288中描述，其通过引用W其整体并入本文。
[0134] 如本文所使化术语"多价DVD"或"pDVD"指多价DVD-Ig分子，如在美国临时申 请系列号61/746, 616中描述，其通过引用W其整体并入本文。
[0135] 如本文所使用，术语"受体DVD"或"rDVD"指受体-DVD-Ig分子，如在美国临时 申请系列号61/746, 617中描述，其通过引用W其整体并入本文。
[0136] 如本文所使用，术语"英夫利昔单抗"指销售为REMICADE?的抗TNF抗体，化学 文摘服务（CA巧命名为170277-31-3。
[0137] 如本文所使用，术语"戈利木单抗"指销售为SIMP0NI?的抗TNF抗体，化学文摘 服务（CA巧命名为476181-74-5。
[0138] 如本文所使用，术语"赛巧珠单抗"指销售为CIMZIA?的抗TNF抗体，化学文摘服 务（CA巧命名为428863-50-7。
[0139] 如本文所使用，术语"阿达木单抗"指销售为HUMIRA?的抗TNF抗体，化学文摘服 务（CA巧命名为331731-18-1。
[0140] 如本文所使用，术语"英夫利昔单抗"指销售为ENBREL?的抗TNF免疫粘合素，化 学文摘服务（CA巧命名为1094-08-2。
[0141]术语"人TNF-a"，如本文所使化旨在指人细胞因子，其展示为17kD分泌形式 和26kD膜结合形式，其生物活性形式由单价结合的17kD分子H聚体组成。人TNF-a的 结构进一步描述在，例如，化nnica,D.，等（1984)化 1:ure312 ;724-729 ;Davis,J.M.，等 (1987)Biochemist巧 26 ; 1322-1326 ;和化nes，E.Y.，等（1989)化Uire338 ;225-228。术 语人TNF-a旨在包括重组人TNF-a，其可通过标准重组表达方法by或商业上购买（R&D Systems,目录No. 210-TA,Minneapolis,Minn.)。
[0142] 术语"抗体"，如本文所使用，通常指由四条多肤链组成的任何免疫球蛋白（Ig) 分子，两条重（H)链和两条轻（L)链，或任何功能片段、突变体、变体，或其衍生物，其保持Ig 分子的基本的抗原决定部位结合特征