适用于提高胎儿体重增加并增强骨特性的可可碱组合物的制作方法
【专利说明】适用于提高胎儿体重增加并增强骨特性的可可碱组合物
[000。 背景
[0002] 1.领域
[0003] 本披露设及W下组合物和方法，运些组合物和方法用于在对其有需要的受试者中 增强骨形成、增加骨密度、增加内部骨骼的互连、增加骨量、治疗软骨和/或骨缺损或其组 合，从而在孕前（preconception)、妊娠、哺乳和/或产后阶段期间改善孕产妇和/或儿童健 康并且提高间充质干细胞（MSC;也称为"骨髓基质细胞"或"多潜能性基质细胞"）中的成 骨细胞/成骨活性。更具体地说，所述组合物包含可可提取物。
[0004] 2.相关技术说明
[0005] 可可碱（IUPAC名称：3, 7-二甲基-2, 3, 6, 7-四氨-1H-嚷岭-2, 6-二酬；还被称 为3, 7-二甲基黄嚷岭）是一种白色（或无色）苦味的结晶粉末，具有290°C至295°C的升华 点、357°C的烙点W及180. 16g/mol的分子量。可可碱在水中的溶解度是1. 0g/2L;在沸水中 的溶解度是1. 0g/150mU并且在95%乙醇中的溶解度是1.Og/2. 2L。可可碱与咖啡因和茶 碱化学上相关，并且存在于众多食物中，运些食物包括巧克力、可可、茶叶、W及己西替。可 可碱、茶碱（1,3-二甲基黄嚷岭）化及咖啡因（1，3,7-S甲基黄嚷岭）的化学结构分别如 W下化学式I、IIW及III所给出。
[0006]
[0007] 可可碱^从约1.5%至约3%的浓度天然存在于可可豆（可可〇116〇13'〇111曰 cacao))中，并且W从约0. 7%至约1. 2%或约15至约30g/Kg的浓度天然存在于可可豆的 壳中（溫霍尔茨（Winholdz)，1983)。虽然是同一化学家族的部分，但是人们必须区分可可 碱的刺激作用与咖啡因的刺激作用。咖啡因作用相对较快，并且它对人的主要作用是提高 精神警觉性；可可碱的作用更为微妙，并且引起比咖啡因更溫和更持久的情绪高涨。在血流 中，可可碱的血浆半衰期（ti/2)是六小时，而咖啡因的血浆半衰期仅是两小时。另一个区别 是，可可碱不是生理成癒性的，从而在长期定期摄入之后不会产生戒断症状，而咖啡因已被 证明是生理成癒性的并且与许多已证明的戒断情况相关。
[0008] 如在此所用，"可可碱"是指可可碱、可可碱的盐或复盐、或包含可可碱的共晶体。
[0009] 在20世纪80年代进行的两项独立研究发现，8个品种的商业可可粉中可可碱的平 均水平是1. 89% (夏夫利和塔卡（Shively&Tarka)，1984和泽马斯狂oumas)等人，1980)。 特别相关的是W下表1中所示的可商购的食品中存在的可可碱的正常水平。
[0010]
[0011] 来源：泽马斯等人，1980 ;布劳克和塔卡度lauch&Tarka)，1983 ;夏夫利和塔卡， 1984 ;克雷格与阮（Craig&Nguyen)，1984。
[0012] *可可碱含量通过HPLC/反相柱色谱法测定
[0013] 在任何类型的巧克力中，黑巧克力含有最高水平的可可碱/份，但浓度倾向于在 约0. 36%与约0. 63%之间变化。为了用表1中提及的食品正确理解运种情况，一盎司黑巧 克力条含有约130mg可可碱，而一盎司牛奶巧克力条含有约44mg可可碱。因此，一盎司黑 巧克力条中可可碱的浓度是一杯5盎司热巧克力中的量的大约两倍。对于一个143磅的人 来说，要在其血液中达到可可碱的毒性水平，他们将必须一次摄取大约86个一盎司牛奶巧 克力条。
[0014] 可可碱也可W作为胺盐（例如，其乙二胺盐）或其复盐（例如，与有机酸的碱金属 盐或碱±金属盐，例如，乙酸、葡糖酸、苯甲酸或水杨酸的碱金属或碱±金属盐）分离或产 生。可W制备运些复盐W使得可可碱更具水溶性抑或W制得不溶性络合物。
[001引在1966年，斯特罗尔福什巧城1拉rs)报道了用富含巧克力的饮食喂食的仓鼠中 離齿减少。斯特罗尔福什的研究通过比较可可粉、脱脂可可粉W及可可脂检查了对仓鼠離 齿的作用。当可可粉构成仓鼠饮食的20%、10%、5%w及2%百分比时，纯可可粉对应地 抑制84 %、75 %、60 %、W及42 %的離齿。脱脂可可显示出比含脂可可粉显著更高的抗離 作用，但单独的可可油（构成仓鼠饮食的15%)显著增加了離齿（斯特罗尔福什A."透 析、退较或碳处理的可可水提取物对仓鼠離齿的作用"（"EffectonHamsterCariesby Dialyzed,DetannedorCarbon-treatedWater-ExtractofCocoa") 口腔生物学文献 (ArchOralBiol.) 1966;11:609-15)。
[0016] 在一个随访研究中，斯特罗尔福什研究了可可粉的脱脂部分，并且证实用水洗涂 的可可粉具有比未洗涂的可可粉显著更小的抗致離作用。然而，斯特罗尔福什仍在洗涂的 可可粉组中观察到显著的抗離作用，"指示非水溶性防離因子的存在"并且提到"可可中两 种離齿-抑制性物质的存在：一种是水溶性的并且另一种是微溶于水的"（斯特罗尔福什， A. ，1966)。
[0017] 后续研究表明在存在可可碱时体外生长的憐灰石晶体显著大于在不存在可可碱 时生长的那些（参见，例如，美国专利号5,919, 426和6, 183, 711，运些专利各自通过引用W其全部内容结合）。哺乳期大鼠的可可碱摄取与暴露于可可碱的哺育期幼鼠的整个第一颗 磨牙中径憐灰石微晶大小增加（更高结晶度）（与对照相比）W及抗酸溶解性的提高相关 (参见同上）。暴露于可可碱的哺育期雌性幼鼠的股骨比性别匹配的对照证实更高结晶度， 并且更坚固且更坚硬；然而，雄性幼鼠的股骨未显示出运种关系（参见同上）。
[001引然而，化11-Petch关系指示，固体材料对永久变形的抗性（例如，其压痕硬 度）在颗粒大小减小时提高。因此，在暴露于可可碱后观察到的径憐灰石结晶度的提 高一一与化11-Petch关系一起一一表明骨骼和牙齿对压痕和永久变形的抗性将在暴 露于可可碱之后由于更大的晶体大小而应该降低。该结论在近期工作中得到了支持， 证实"当晶粒大小从亚微米减少至纳米时，[径憐灰石]的硬度遵循化11-Petch关 系"（王J.等人"硬度和粗糖度同时增强的纳米结晶径憐灰石"（"Nanoc巧stalline hydroxyapatitewithsimultaneousenhancementsinhardnessandtoughness"）生 物材料度1〇111曰*6'1曰13.)2009;30:6565-72)。另一项研究表明径憐灰石的"硬度"与颗 粒大小关系不大，从而表明随着晶粒大小减小，硬度几乎无变化，但表明径憐灰石的"断 裂初度"随着颗粒大小减小而提高（马扎赫瑞M(Maz址eriM)等人，"一种新型烧结工 艺对径憐灰石陶瓷的机械特性的作用"（"Effectofanovelsinteringprocesson mechanicalpropertiesofhydroxyapatiteceramics.")合金与化合物杂志（J.Alloys Compd.)2009;471:180-4)。一项人恒牙和乳（婴儿）牙的研究证实，"当与恒牙相比较时， 婴儿牙釉质更薄、更软、更易断裂并且具有更大[径憐灰石]晶粒"（洛IM化OWIM)等人 "绘制人类牙齿的结构、组成W及机械特性"（"Mappingthestructure,compositionand mechanicalpropertiesofhumanteeth.")材料科学与工程，C辑：生物材料应用（Mater SciE；ngCMaterBiolApp.) 2008;28:243-47)。
[0019] 由于运类冲突和矛盾的结果，人们无法推断已知的特性并且用于预测可靠或准确 结果的径憐灰石对环境因素的反应无法仅通过评价现有技术和推断某个结果来预测。
[0020] MSC的特征在于它们能够产生子代干细胞W及分化成许多不同细胞类型，包括但 不限于：成骨细胞、支持血细胞生成和破骨细胞生成的基质细胞、软骨细胞、肌细胞、骨髓的 脂肪细胞、神经细胞、W及P-膜岛细胞。因此，MSC提供终生骨发育、骨重塑W及血细胞生 成所需的成骨细胞和基质细胞。
[0021] 在人类中，骨形成开始于胎儿发育的前6至8周期间。间充质来源的祖干细胞迁移 至预定部位，其中它们：(a)凝聚、增殖并且分化成骨形成细胞（成骨细胞），在烦骨中观察 到并且被称为"膜内骨形成"的一种过程；抑或化）凝聚、增殖并且分化成作为中间体的软 骨形成细胞（成软骨细胞），运些中间体随后被骨形成细胞代替。更确切地说，间充质干细 胞分化成软骨细胞。然后软骨细胞变得巧化、经历过度生长并且被由现存在于该部位的分 化的成骨细胞组成的新形成的骨骼所代替。接着，矿化的骨骼广泛重塑，其后变得被一种充 满功能性骨髓元素的听骨所占据。该过程在长骨中观察到并且被称为"软骨内骨形成"。在 后胎儿期，骨能够在损伤时通过模拟胚胎软骨内骨发育的细胞过程而自我修复。也就是说， 来自骨髓、骨膜W及肌肉的间充质祖干细胞可被诱导W迁移至缺损部位并且开始上述级联 事件。它们在那里积累、增殖并且分化成软骨，该软骨随后被新形成的骨骼代替。
[0022] MSC在骨髓中是极稀少的，并且由晒齿类动物或人类骨髓体外扩增运些MSC的早 期尝试已证明是困难的。此外，诱导祖细胞的增殖并分化成功能性骨骼、软骨、肌腫和/或 初带组织已显示出需要多种蛋白质，包括但不限于：骨形态发生蛋白度M巧家族成员和生 长因子的TGF-P超家族成员。因为蛋白质更大、更复杂并且由活细胞合成，所W运类蛋白 质的制造、分离W及纯化必然比小分子化学化合物要更复杂、更昂贵。
[0023] 因此，仍然存在对能够诱导祖细胞增殖成功能性骨骼、软骨、肌腫和/或初带组织 的小分子化学化合物（尤其是已知无毒性的那些）的需要。
[0024] 在权利要求书中表征的实施例提供了运种技术问题的解决方案。
[00巧]概述