一种用于治疗神经胶质瘤的新二萜化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及从白背叶的干燥叶中分离得到的一种具有治 疗神经胶质瘤作用的二祗类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 白背叶为大戟科化地orbiaceae野桐属植物白背叶MallotusapeltaiXour.)Muell.Arg.[RicinusapeltaLour.]的根或叶，又名酒药子树、白膜叶等。味微苦、涩，性 平。我国主要分布于江苏、安徽、江西、福建、河南、广西、海南、陕西、云南等地。白背叶在民 间应用广泛，主要W根及叶入药，根具有柔肝活血，健脾化湿，收敛固脱之功效，常用于慢性 肝炎，肝脾肿大，子宫脱垂，脱肛，白带，妊娠水肿；叶能消炎止血，主要是外用，常用于中耳 炎，巧肿，跌打损伤，外伤出血。
[0003] 该属植物含有丰富的化合物类型，主要W苯并化喃类、香豆素类、=祗类W及祗类 化合物为主。苯并化喃衍生物主要存在于白背叶的叶子中；香豆素类化合物主要存在于叶 子中，根和茎亦有分布；=祗类化合物在白背叶的根、茎、叶中均有分布。祗类化合物W二祗 类为主，存在于叶子中。此外，白背叶还含有生物碱类、黄酬类W及挥发性成分。
[0004] 研究表明白背叶叶子部分有良好的止血、抗肿瘤作用，根部分具有较好的抗病毒 和保肝活性，特别是某些化学成分具有强烈的抑制HIV、逆转录酶或细胞DNA聚合酶的活 性，提示其具有应用于治疗乙肝和艾滋病的潜力。此外，有研究表明，白背叶根水煎剂对金 黄色葡萄球菌有抑制作用，乙醇提取物能够抑制志贺频疾杆菌；从根中分离出的化合物均 能在不同程度上抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌及绿脈杆菌。白背叶煎剂和浸剂 能使钉螺的死亡率达到30 %~60 %。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种从白背叶的干燥叶中分离得到的一种具有治疗神经胶 质瘤作用的二祗类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0008]
[0009] 所述的化合物（I)的制备方法，包含W下操作步骤：(a)将白背叶的干燥叶粉 碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和 水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；化）步骤 (a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80%乙醇洗 脱10个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏；(C)步骤化）中 80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分 2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱， 收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0010] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85%。
[0012] 一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的 载体。
[0013] 所述的化合物（I)在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可W直接使用，或者W药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 W及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物W单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】 阳〇1引图1为化合物（I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较；
[0020] 图3为化合物（I)处理后U251细胞桐调亡率的变化。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 阳02引实施例1 :化合物（I)分离制备及结构确证
[0023] 试剂来源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 制备方法：(a)将白背叶的干燥叶（10kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（2^X3 次），合并提取液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油酸（化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水 饱和的正下醇0LX3次）萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物（431g)和正下醇 萃取物；化）步骤（a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10 %乙醇洗脱8个柱 体积，再用80 %乙醇洗脱10个柱体积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物 浸膏（157g) ;(c)步骤化）中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8 个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、12:1 (8个柱体积）和1:1巧个柱体积） 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4 (49g)用正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为20:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积）和5:1 (8个柱体积）的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (23g)用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I) (34mg)。 阳0巧]结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z395. 1508,结合核磁特征可得分子式 为C2化A，不饱和度为10。核磁共振氨谱数据5H(Ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-1(2.98， d)，H-1 (2. 73,d)，H-3 (6. 85,s)，H-6 (2. 63,m)，H-6 (1. 25,t，J= 14. 4)，H-7 (1. 24,m)， H-8 (1. 55,m)，H-8 (1. 78,m)，H-9 (2. 52,dd，J= 8. 4, 2. 4)，H-10 (2. 06,dt，J= 12. 0, 2. 4)， 82,ddd，J= 10. 2,8. 4，1. 2)，H-12(4. 94,br，s)，H-14化.41，br，s)，H-15(7. 33， br，s)，H-16 (7.33,br，s)，H-17 (0.99,dd)，H-19 (1.20,s)，18-0Me(3.61，s);核磁共 振碳谱数据 5c(卵m，DMSO-de，150Hz) :38. 3 (邸2,1-C)，198. 9 (C，2-C)，130. 0 (CH，3-C)， 156. 9 (C，4-C)，36. 1 (C，5-C)，32. 9 (邸2, 6-C)，34. 8 (CH，7-C)，24. 2 (邸2, 8-C)，42. 0 (CH， 9-C)，37. 6 (CH，10-C)，39. 2 (CH，11-C)，78. 5 (CH，12-C)，123. 3 (C，13-C)，108. 2 (CH，14-C)， 143. 9 (CH，15-C)，138. 8 (CH，16-C)，12. 2 (邸3, 17-C)，167. 0 (C，18-C)，23. 1 (細3,19-C)， 177. 7(C，20-C)，51.3(CH3，18-0Me);碳原子标记参见图1。NMR谱表明，该化合物含有立个 甲基[5册.99((1(1，&-17)，1.20(3，&-19)和3.61(3，18-(116)]，^个亚甲基[5肥.98((1， H-1)，2. 73 (d，H-1)，2. 63 (m，H-6)，1. 25 (t，J= 14. 4Hz，H-6)，1. 55 (m，H-8)，1. 78 (m，H-8)]， 六个次甲基[5册.85(s，H-：3)，1.24(m，H-7)，2. 52(dd，J= 8. 4,2. 4Hz，H-9)，2. 06(化， J= 12. 0,2. 4Hz，H-10)，2. 82(ddd，J= 10. 2,8. 4，1.2Hz，H-ll)，4. 94 化r，s，H-12); 5C130. 0 (C-3)，34. 8 (C-7)，42. 0 (C-9)，37. 6 (C-10)，39. 2 (C-11)，78. 5 (C-12)]，一个e单 取代巧喃环[5C123. 3 (C-13)，108. 2 (C-14)，143. 9 (C-15)和 138. 8 (C-16)]，两个内醋幾基 [5C167. 0 (C-18)和 177. 7 (C-20) ]，W及一个a，P-不饱和幾基[5C198. 9 (C-2)]。根据 HMBC谱中H-12与C-14和C-16的相关性，可推断巧喃环位于C-12位上。N犯SY谱中&-19 与H-10，H3-19与H-7,化及H-7与H-12的相关性，表明它们均为a取向。综合氨谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立 体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0027] 一、材料和仪器
[002引本实验采用人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞株，购自美国模式菌种收集中屯、。DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；氯化钢、氨氧化钢、氯化钟、氯化氧、氨氧化钢、 憐酸氨二钢、憐酸二氨钢、憐酸二氨钟、甲醇购自南京化工厂。化合物（I)自制，HPLC归 一化纯度大于98 %。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亚讽（DMEM)购自美国Sigma公司； Aimexin-V/PI细胞调亡试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞裂解液、0.25%膜蛋白酶、 CellCountingKit-8 试剂盒、青霉素、链霉素、Hoechst33258、细胞核染料DAPI、PMSF、 Westernblot凝胶配制试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒、考马斯亮蓝染色液、标准蛋白、5X 蛋白质变性缓冲液盒、E化超敏发光液、显影定影试剂盒、X线胶片、硝酸纤维素膜、抗巧光 泽灭封片液购自江苏碧云天生物研巧所。胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司；兔抗人 P65抗体购自美国N0VUS公司；兔抗人化stonH3抗体购自美国CST公司；山羊抗兔HRP二 抗购自美国Santa化UZ公司；山羊抗兔巧光二抗购自美国Earth化公司。
[0029]-20°C低溫冰箱（海尔青岛），-80°C低溫冰箱（海尔青岛），低溫冰箱（海尔青岛）， 高速离屯、机（飞鹤上海），培养皿/板（Coming美国），离屯、管（Coming美国），细胞培养箱 灯hermo美国），倒置显微镜（Olympus日本），巧光倒置相差显微镜狂EISS德国），多用途 恒溫水浴箱（跃进上海），电子天平仪（上海机密科学仪器），超净