一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原体体外诊断技术领域，具体设及一种假病毒颗粒及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术的迅速发展，W聚合酶链式反应为基础的各种分子生物学诊 断技术，因其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，方便快捷等优点，成为生物医 学领域内最有价值的研究手段，已经广泛应用于临床标本的检测。在RNA病毒RT-PCR检测 中，实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间溫度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、 待扩增祀核酸的浓度、逆转录的效率及试剂问题等，均可能会影响PCR扩增的效率，进而造 成结果的偏差。核酸扩增检测想得到可靠的结果，必须使用质控品进行严格的质量控制，即 需要特定的质控品。质控物须具备W下特点：（1)容易制备；（2)在胆存和使用过程中稳定 性好；（3)无生物传染性；(4)能监控整个检测过程，结果可靠。
[0003] 造成人间流感流行的病毒主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒。甲型和乙型流感 病毒均属正粘病毒科，其基因组都是由8节段的负链单股RNA组成。其结构主要由=部分组 成：1.核屯、：位于病毒最内层，由核酸和核蛋白组成。2.基质蛋白（M蛋白）：位于病毒脂质 包膜下，并与膜结合的蛋白。3.包膜：位于基质蛋白之外的双层脂质，来源于宿主细胞膜， 其包含有两种重要的糖蛋白，具有重要的抗原性：即血凝素（HA)和神经氨酸酶（NA)。依据 HA和NA蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个H亚型化1-H16)和9个N亚型 (N1-N9)。流感病毒可感染呼吸道的所有各类细胞，并能在其内复制，其致病的主要机制是 病毒复制引起的细胞损伤及死亡。
[0004] 由于天然病毒潜在的传染危险性及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品如 灭活的病毒颗粒、cDNA、质粒DNA、裸露的RNAW及体外转录RNA，都难W达到试验要求，所W 研制稳定的、无生物传染性的质控品，不但对RNA病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒 RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。
[0005]病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空屯、颗粒，不含病毒核酸， 不能自主复制，但可W组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似， 具有很强的免疫原性及很好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样颗粒与重组质粒DNA 融合，转录成的重组RNA包入病毒样颗粒内，即形成假病毒。假病毒具有模拟真病毒结构、 能够抵抗核酸酶降解、稳定、安全性高等优点，给目前RNA病毒检测研究工作提供了一种强 有力的工具。MS2隧菌体是单链正链RNA病毒，为26nm长的20面体，共有3569个核巧酸， 包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子。隧 菌体由180个包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成，在MS2隧菌体包 膜蛋白的研究中发现包膜蛋白与隧菌体复制酶5'端由19个碱基（19,mer)组成的茎环结 构RNA序列有特异性相互作用，运种作用可引发隧菌体外壳的组装，同时，将隧菌体基因组 RNA包装到包膜内。
【发明内容】
[0006] 本发明需要解决的技术问题是提供了一种含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和 0-actin=种检测片段的假病毒颗粒；该假病毒具有模拟真病毒结构、能够抵抗核酸酶降 解、稳定、安全性高等优点，并且易于制备、保存和运输，可作为甲型流感病毒及乙型流感病 毒核酸检测试剂盒中质控品。该方法具有快速、客观准确等技术效果。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0008] -种假病毒，其是由MS2隧菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流 感病毒和P-actinS种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。
[0009] 在其中一个实施例中，所述甲型流感病毒的碱基片段为SEQIDN0:3或对SEQ IDN0:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核巧酸序列。
[0010] 在其中一个实施例中，所述乙型流感病毒的碱基片段为SEQIDN0:4或对SEQ IDN0:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核巧酸序列。
[0011] 在其中一个实施例中，所述P-actin的碱基片段为SEQIDN0:5或对SEQIDN0:5 进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核巧酸序列。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种上述假病毒的制备方法。
[0013] 实现该目的的技术方案如下。
[0014] 一种上述假病毒的制备方法，包括W下步骤：
[001引 （1)设计针对MS2隧菌体基因组的引物，进行RT-PCR扩增得到约1780bp的产物， 包含MS2隧菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列；
[0016] (2)将扩增产物插入原核表达载体PSE380中，构建重组质粒PSE380-MS2 ;
[0017] (3)将所得到的重组质粒PSE380-MS2转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养， 提取质粒；
[0018] (4)得到含有依次由甲型流感病毒、乙；型流感病毒和P-acting种碱基片段 串联而成的检测序列的核巧酸序列，该核巧酸序列的两端带有限制性内切酶Bglll和 HinduI的酶切位点；
[0019] (5)将步骤（4)所得到的核巧酸序列与重组质粒PSE380-MS2进行连接，构建重组 质粒PSE380-MS2-AB;
[0020] (6)诱导重组质粒PSE380-MS2-AB的表达与纯化；即得。
[002。 在其中一个实施例中，步骤（1)中针对MS2隧菌体基因组的引物为SEQIDNO: 1 和沈QIDNO:2。
[002引在其中一个实施例中，步骤（4)为：用扩增引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:8,W SEQIDN0:6为模板进行扩增，得到的扩增产物即为所述核巧酸序列。
[0023] 在其中一个实施例中，步骤化）中的诱导表达与纯化包括W下步骤：
[0024] 6. 1、将PSE380-MS2-AB重组质粒的阳性菌落，涂布于含氨节霉素的LB固体培养基 平板；
[00巧]6. 2、挑取单菌落接种到含氨节霉素的LB液体培养基中；
[002引 6. 3、培养至A600nm为0. 5-1. 0时，加入IPTG(异丙基-0 -D-硫代半乳糖巧），诱 导表达形成病毒颗粒；
[0027] 6. 4、采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶 I将裸露的RNA与DNA降解；
[0028] 6. 5、离屯、收集上清，鉴定，将鉴定正确的病毒样颗粒保存。
[0029] 本发明的另一目的是提供上述假病毒的应用。
[0030] 实现上述目的的技术方案如下。
[0031] 上述假病毒作为甲型流感病毒和/或乙型流感病毒检测中的外标质控品的应用。
[0032] 在其中一个实施例中，所述质控品为甲型流感和/或乙型流感病毒检测中的强阳 性对照和临界阳性对照。
[0033] 本发明的另一目的是提供了一种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试 剂盒。
[0034] 实现上述目的的技术方案如下。
[0035]甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括有检测试剂和外标质控 品，所述外标质控品为上述假病毒颗粒。
[0036] 本发明的另一实施例中，所述试剂盒的检测试剂包含核酸提取试剂，例如所述核 酸提取试剂包含核酸提取液A、B、C及样本稀释液；核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包含 Inf.A/Inf.B/P-actin扩增反应液，TaqDNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
[0037] 此外，还可W包括有使用说明书。
[003引所述外标质控品为强阳性对照，临阳性对照；强阳性对照，临阳性对照为上述假病 毒颗粒。
[0039] 本发明设计了一种新的用于甲型流感病毒、乙型流感病毒的质控品的假病毒颗 粒，该假病毒颗粒含有包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和P-actinS种碱基 片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体，该含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和 0-acting种检测片段的假病毒颗粒，经试验验证该病毒样颗粒具有W下几个方面的优 点：1、无传染性，在制备和使用时对人员和环境均无危险；2、稳定性好，耐RNA酶；3、在进行 核酸提取及PCR鉴定过程中可全程检测整个实验过程。本发明可作为甲型流感病毒及乙型 流感病毒核酸检测试剂盒中的质控品，具有很强的实用价值。
【附图说明】
[0040] 图1为实施例1中质粒PSE380的图谱；
[00川图2为实施例2中强阳性对照和临界阳性对照均匀性实验的巧光PCR检测结果；
[0042]图3为实施例3中强阳性对照和临界阳性对照稳定性试验的巧光PCR检测结果； [004引图4为实施例4中5份临床样本的第一次巧光PCR检测结果；
[0044] 图5为实施例4中5份临床样本的第二次巧光PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0045] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供运些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0046] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborL油oratoryPress, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 广品。
[0047] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任意的和所有的组合。
[004引 实施例1
[0049] 本实施例含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和P-actinS种检测片