对河流弧菌o1，o6，o7，o8和o9特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及对河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型特异的核巧酸，尤其设及对河 流弧菌01，06, 07, 08和09血清型0抗原基因簇中单个基因特异的核巧酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 河流弧菌为革兰氏阴性菌，是海洋环境的主要栖息菌之一，广泛存在于河流和出 海口环境水域，也是人类与水生生物主要的细菌性病原之一，可W起鱼、邮、贝等多种养殖 动物的疾病，给养殖业带来严重的经济损失。河流弧菌还可W通过各种食物导致人类严重 的流行性腹泻，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被认为是一种全 球性的人兽共患的新型病原菌。它的分型与鉴定是海洋菌种库建立的重要前提之一。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法W及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型运 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的0抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 河流弧菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为河流弧菌菌种与株型鉴定的重 要依据，不少新菌也因此产生。对弧菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形 态的内容，核酸的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，河流弧菌的分型 与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸(包括基因组与核酸片 段）的相似性确定河流弧菌的归属。
[0005] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（口巧序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFL巧分析等。分子生物学方法不仅可用于河流弧菌的快速血清分型筛查，稳定的 鉴定结果可W弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，运些基于多聚酶链式 反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵 敏、特异性强等优点。
[0006] 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离屯、及裂解制备 细菌DNA模板，就可W在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。运对检验检疫部 口和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为河流弧菌的防控 提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了本发明设及对河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型特异 的核巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 沈QIDNO: 1-10所示的核巧酸中的至少一种；所述的沈QIDNO: 1-10如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DM聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO: 1-10所示的核巧酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂： 10mldNTP30y1 ; 10X酶特异性反应缓冲液50y1 ;5U/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;引物 混合物10y1 ;阳性对照品10y1;阴性对照品10y1 ;d地2〇 5ml。
[0009] 其中所述的PCR引物优选为所述如SEQ ID NO: 1-10所示的核巧酸中的至少一种。
[0010] 本发明进一步公开了对河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型特异的SEQID NO: 1-10核巧酸在制备用于检测河流弧菌河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型的PCR试剂 盒、基因忍片或微阵列方面的应用。
[0011] 本发明所述河流弧菌可W取样于自来水、河流水、海水的培养物的粗提液，或是河 流弧菌的纯培养物的粗提液等。
[0012] 收集河流弧菌提取基因组是采用常规方法制备获得。
[0013] 针对河流弧菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结 果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样 本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
[0014] 本发明还提供一种基因忍片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核巧酸探 针，其中所述寡核巧酸探针包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸优选为如SEQIDNO: 1-10 所示的核巧酸。
[0015] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸优选为如SEQ IDNO: 1-10所示的核巧酸。
[0016] 本发明进一步公开了对河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型特异的核巧酸在制备 用于检测河流弧菌PCR试剂盒方面的应用。在制备用于检测河流弧菌的基因忍片方面的应 用。在制备用于检测河流弧菌微阵列方面的应用。所述的检测河流弧菌指的是检测引起严 重腹泻，败血病，小肠结肠炎，脑膜炎，眼内炎，海洋生物感染的细菌。
[0017] 本发明公开的对河流弧菌01，06, 07, 08和09血清型特异的核巧酸与现有技术相 比，本发明具有如下优点： (1)实用性强 本发明建立的一种PCR反应体系，可检测河流弧菌，提供血清分型检测所用到的特异 引物，利用该PCR方法可W对临床标本进行检测。
[001引 （2)准确性高 本发明通过对河流弧菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的条 带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可W得到河流弧菌所属的血清型。
[0019] (3)检测成本相对较低 可W推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致 病菌检测组合提供技术模式。
[0020]
【附图说明】： 图1表示本发明01血清型特异引物检测河流弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图， r巧基因P1和P2引物的筛选，目的条带为10化P，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信 息见表2 ; 图2表示本发明01血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 6株弧菌 W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本发明06血清型基因P3和P4引物检测河流弧菌其他血清型标准菌株电 泳结果图，r。基因P3和P4引物的筛选，目的条带为114bp，其余的血清型没有任何条带。 具体菌株信息见表2 ; 图4表示本发明06血清型WZY基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2。
[0021] 图5表示本发明07血清型基因P5和P6引物检测河流弧菌其他血清型标准 菌株电泳结果图，r。基因P5和P6引物的筛选，目的条带为118bp，其余的血清型没有任何 条带，具体菌株信息见表2; 图6表示本发明07血清型基因P5和P6引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图7表示本发明08血清型基因P7和P8引物检测河流弧菌其他血清型标准菌株电 泳结果图，rZf盖嫁尸7游化引物的筛选，目的条带为l(Ubp，其余的血清型没有任何条带。 具体菌株信息见表2 ; 图8表示本发明08血清型基因P7和P8引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2 ; 图9表示本发明09血清型基因P9和P10引物检测河流弧菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，rZf盖嫁尸的？7 W巧I物的筛选，目的条带为l(K)bp，其余的血清型没有任何条 带，具体菌株信息见表2; 图10表示本发明09血清型盖嫁尸的？7 W巧I物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 用盖嫁的？7 W巧I物检测了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带， 具体菌株信息见表2 ; 图11表示分别用01，06, 07, 08和09特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌 株信息见表2 ; 其中：01，06, 07, 08和09和负对照（-)表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳道H和最后一个泳道是2000bpladdermarker。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的条件。其中河流弧菌来源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)o
[0023]连施例1:基闲紀的提取 37°C营养肉汤培养基培养河流弧菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下： 用500ul50mMTris-肥l(p册.0)和lOul0. 4M邸TA重悬细胞，37°C溫育20分钟，然 后加入lOullOmg/ml的溶菌酶继续保溫20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小时，再加入3ullOmg/ml的RNase，65°C溫育30分钟。加等体积酪 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酪：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙酸抽提W除去残余的酪。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0024]连施例2:序列破译 提取河流弧菌01，06,07,08和09血清型标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测 序技术对河流弧菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast 及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMM2. 0program进行跨膜结构预测，运用ClustalW program进行序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得河流弧菌各个血清型的0抗 原基因簇序列及破译结果。
[00巧]连施例3:引物巧计 河流弧菌01，06, 07, 08和09各个血清型的0抗原基因簇序列是本实验室自测的，通 过比对分析，我们选取Blast比对结果identity和similarity值相对较低的基因特异区 段设计引物。其中01血清型的r巧基因比对结果identity值和similarity值为