基于rna聚合酶ⅰ的rsv微型复制基因组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物医学领域，更具体地，设及建立抗病毒药物的筛选 方法。
【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒（HumanRespiratorySyn巧tialViru，RSV)是世界范围内引起 婴幼儿和两岁W下儿童下呼吸道感染的最重要的病毒性病原，同时也在老年人和免疫缺陷 人群引起严重感染。目前，利己韦林和帕利珠单抗是仅有的用于RSV治疗和预防的药物，然 而利己韦林由于喷雾给药途径、药效不佳及存在致崎作用，阻碍了其在临床应用，帕利珠单 抗主要用于2岁W下高危儿童且且价格昂贵，也未得到广泛使用。因而，开发新的抗RSV药 物成为亟待解决的问题。而建立高通量的抗RSV药物筛选系统是研发新的抗RSV药物的核 屯、。
[0003] 快速、简便、经济的RSV定量方法是筛选抗RSV药物的基础，随着生物技术的不断 发展，愈来愈多的方法被用于RSV定量检测，但都存在一定问题，难W用于高效筛选抗RSV 药物。如：实时定量PCR因其高敏感和高特异性被用于定量RSV，但该方法不能区分活病毒 和死病毒，限制了其在抗RSV药物筛选中的应用；酶联免疫吸附法巧LISAs)需要大量特异 性抗体，导致该方法价格昂贵，难W用于大规模筛选抗RSV药物；基于细胞病变效应（CP巧 的RSV定量方法存在耗时较长、工作量较大、容易受操作人员主观因素影响等缺点，也不适 用于大规模样品的检测。
[0004] 随着负链RNA病毒反向遗传学技术的发展，利用N、P、M2-1、L四种蛋白和病毒编 码蛋白被报告基因取代了的微型复制基因组（Minigenome)模拟RSV的复制和转录过程成 为了现实。W此为基础，有研究者构建了T7聚合酶驱动的RSV微型复制基因组，并用于定 量RSV和筛选抗RSV药物，获得了不错的效果。但是，T7聚合酶驱动的RSV复制系统需要 通过表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒、瞬时转染或建立稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系 等方法提供T7RNA聚合酶，导致难W在宿主细胞内获得高水平的T7RNA聚合酶，进而限制了 该系统的效率。另外，T7聚合酶驱动的RSV微型复制基因组转录后，会在的3'末端留有多 余的外源基因片段，为去除该多余的基因片段，需要在微型基因组3'末端添加下肝核酶， 通过下肝核酶将多余的基因片段切除掉，由于下肝核酶切割效率有限，因而限制了功能性 微型复制基因组的转录。
[000引真核RNA聚合酶包括立种，分别是RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III，其 中RNA聚合酶I位于真核细胞细胞核内，负责转录核糖体RNA，RNA聚合酶II位于细胞质中， 负责合成信使RNA(mRNA)的前体，RNA聚合酶III位于细胞质中，负责合成转运RNA(tRNAs)。 利用真核RNA聚合酶启动子的真核表达载体，需要具有RNA聚合酶的启动子，运样的表达载 体能够在真核细胞中瞬时或永久表达目标基因。用于真核表达的载体通常采用RNA聚合酶 II的启动子，但RNA聚合酶II的启动子并不能用于制备的RSV微型复制基因组。
[0006] 因而需要提供一种可在真核细胞表达的RSV微型复制基因组，及包含该RSV微型 复制基因组的载体。
【发明内容】
[0007] 本发明的要解决的第一个技术问题是提供了一种基于RNA聚合酶I的RSV微型复 制基因组。
[000引本发明要解决的第二个技术问题是提供一种包含基于RNA聚合酶I的RSV微型复 制基因组的真核表达载体。
[0009] 本发明要解决的第=个技术问题是包含基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组 的真核表达载体在筛选抗RSV化合物中的应用。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用如下述技术方案：
[0011] 一种基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组，其包含RNA聚合酶I启动子和 Gaussia巧光素酶（Glue)报告基因，所述微型复制基因组序列如seqIDNo:l所示。
[0012] 在基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组中，我们保留了RSV前导序列化eader re邑ion/邑enomicpromoter)、牵专录起女台f言号（Genestartsignal，GS)、牵专录终ihf言号（Gene endsi即al，GE)和尾随序列（Trailerregion/antigenomicpromoter)等顺式作用元件 (Cis-actingelements),用Glue(Gaussialuciferase)基因替代了RSV全部编码基因，并 分别在基因组两端添加了RNA聚合酶I启动子和终止子，获得了基于RNA聚合酶I驱动的 RSV微型复制基因组。
[0013] 通常在建立病毒微型复制子时，需要含有T7聚合酶的启动子，但是T7聚合酶存在 技术背景中所述的两大缺点。我们发现采用含有RNA聚合酶I启动子的RSV微型复制基因 组能够避免运两缺点。
[0014] 一种基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组的pHM-RSV-Gluc表达载体，所述 pHM-RSV-Gluc表达载体的序列如seqIDNo:2所示。该序列全长5638bp，其中228-1390bp 之间为基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组，704-126化P之间为Glue报告基因， 234-470bp之间为RNA聚合酶1启动子。所述pHM-RSV-Gluc表达载体的构建方法如下：构 建抑M质粒；构建基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组；将所述RSV微型复制基因组装 入pHM质粒，即获得pHM-RSV-Gluc表达载体。
[0015] 其中抑M载体的构建方法包括但不限于：WPCDNA3. 1 (+)质粒为模板，PCR扩增 1253bp-2080bp之间的DNA片段，所用的PCR引物为的上游引物为MF，含有MluI酶切位点， 序列如seqIDNo:3所示，所用的PCR的下游引物为：MR，含有SmaI酶切位点，序列如seq IDNo:4所示。用MluI和SmaI双酶切PCR扩增的DM片段，回收82化P的酶切后的PCR 扩增片段，即获得抑M插入片段。同时用MluI和SmaI双酶切所述PCDNA3. 1 (+)质粒，并 回收3579bp的DNA片段，获得第一P歷载体片段，连接抑M插入片段和第一P歷载体片段， 即获得pHM质粒，即删除PCDNA3. 1 (+)质粒上233-1157bp之间片段，即获得pHM质粒，其中 所述PCDNA3. 1 (+)质粒233-1157bp之间片段包含CMV启动子、T7启动子、MCS和BGH反向 引物序列。
[001引所述pcDNA3. 1 (+)质粒购买自Invitrogen公司。
[0017] 其中，含有Glue报告基因和RNA聚合酶1启动子的RSV微型复制子的构建方法包 括但不限于全基因合成方法或PCR扩增法，优选为全基因合成方法，同时为保证稳定性，进 一步将合成的Glue报告基因连接在pUC57质粒体上，获得pUC57 -RSV-Gluc质粒，其中所 述微型复制子的全基因合成和连接是由上海生工完成，其中所述的微型复制子也可W连接 在其他的质粒上。所述pHM-RSV-Gluc表达载体的组装方法为：
[001引 利用MluI和EcoRV内切酶双酶切所述PUC57 -RSV-Gluc载体和抑M载体，回收PUC57 -RSV-Gluc质粒的酶切产物中1163bp片段，获得RSV-Gluc片段；回收抑M载体的酶 切产物中4475bp的片段，获得第二pHM载体片段，用T4DNA连接酶连接RSV-Gluc片段和第 二抑M载体片段，即获得pHM-RSV-Gluc载体。
[0019] 其中DNA片段的PCR、酶切与回收、载体的酶切与回收化及插入片段与载体片段或 质粒片段间的连接可采用本领域技术人员所熟知的技术手段。
[0020] 采用相似或相同的制备原理，基于RNA聚合酶I的RSV微型复制基因组也可W连 接至其他的表达载体中或修改的表达载体中，表达载体的修改方式不限于本申请例举的方 法。
[0021] 所述pHM-RSV-Gluc表达载体转染到真核细胞后不能表达巧光素酶报告基因，仅 当RSV病毒同时感染转染了pHM-RSV-Gluc表达载体的细胞时，才能表达巧光素酶。
[0022] 在一个实施例中，为确定pHM-RSV-Gluc转染的肥P-2细胞中能够正确表达报告基 因，我们将肥P-2细胞培养在96孔板，24h后，接种RSV病毒，接种病毒后2地，参照转染试 剂说明书建议量转染pHM-RSV-Gluc载体，与此同时我们设立2个阴性对照组，分别为转染 pHM-RSV-Gluc载体但不接种RSV组和接种RSV但不转染pHM-RSV-Gluc载体组，和1个空白 对照组，为不接种RSV也不转染pHM-RSV-Gluc载体，转染后4化检测Gaussia巧光（RLU) 信号。仅当转染pHM-RSV-Gluc载体并接种RSV病毒时检测到了Gaussia巧光素酶（Glue) 的巧光信号（R