一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法，适用于以巴斯德毕赤酵母工程菌生产胞外目的产物。
【背景技术】
[0002]传统的毕赤酵母发酵生产外源蛋白方法，主要由甘油分批发酵阶段、甘油补料发酵阶段和甲醇补料发酵阶段三部分组成。整个发酵过程一般需要一周左右，在甘油分批发酵和补料发酵阶段，毕赤酵母不会表达目的产物，只是大量增殖，且甘油价格远远高于甲醇，故此阶段提高了整个工艺的成本；甲醇补料发酵阶段，由于在此前期补加的碳源为甘油，故在补加甲醇的前期，菌体需要一段时间的适应，才能利用甲醇，这也延长了发酵的时间，降低了发酵效率。当整个发酵过程结束后，将获得大量的已经完全适应甲醇环境的菌体，将此菌体丢弃将造成很大的浪费，从而增加了生产的成本，而关于一次发酵后毕赤酵母菌体回收利用的报导几乎没有，本发明就是提供一种回收一次发酵后的毕赤酵母菌体并重复利用的方法。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法，该方法可显著降低后续发酵的成本，缩短发酵的时长。
[0004]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0005]一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法，包括下述步骤:
[0006]A、常规发酵
[0007]即进行常规的毕赤酵母高密度发酵；
[0008]B、第一次重复发酵:
[0009]B1、离心常规发酵后的发酵液，收集菌泥；
[0010]B2、配制重复发酵培养基，加入罐中，灭菌后将收集的酵母菌体也加入罐中；
[0011]所述的重复发酵培养基的配方除了不含有甘油外，其他组分及组分含量与常规发酵培养基相同；
[0012]B3、流加含有1.2% (体积比)微量盐溶液的50% (质量比)甘油，增加菌体活力；
[0013]所述的微量盐溶液的配方包括:6.0g五水硫酸铜，0.08g碘化钠，3.0g 一水合硫酸锰，0.2g 二水钼酸钠，0.02g硼酸，0.5g氯化钴，20.0g氯化锌，65.0g硫酸亚铁，0.2g生物素，5.0ml浓硫酸，加水至总体积为1L。
[0014]B4、甘油消耗完后，饥饿30min，开始流加甲醇，甲醇流加速度为0.05ml/min/L?0.2ml/min/L，所述的甲醇的流加速度是相较于每升培养基而言；
[0015]B5、甲醇消耗完毕后下罐。
[0016]以上所述的方案中，离心收集第一次重复发酵后的菌泥，进行第二次重复发酵:重复步骤BI?B5。
[0017]以上所述的方案中，离心收集第二次重复发酵后的菌泥，进行第三次重复发酵:重复步骤BI?B5。
[0018]以上所述的方案中，其余发酵参数均与常规发酵相同。
[0019]以上所述方案中，优选的:
[0020]步骤B的BI中，先将重复发酵培养基的温度、pH调整与发酵时一致后，先将部分培养基与菌泥混合后，再倒入发酵罐中。
[0021]步骤B的B3中，其流加甘油的量是根据酵母的湿重确定的，甘油消耗完毕时，酵母的湿重培养至250g/L?350g/L。
[0022]以上所述的方案中，优选的，第一次重复发酵使用的菌体量为回收的常规发酵后菌泥总量的四分之三；
[0023]以上所述的方案中，优选的，第二次重复发酵使用的菌体量为回收的第一次重复发酵后菌泥总量的二分之一；
[0024]以上所述的方案中，优选的，第三次重复发酵使用的菌体量为回收的第二次重复发酵后菌泥总量的三分之一。
[0025]以上所述的方案中，步骤A中，毕赤酵母首次发酵的步骤为:配制毕赤酵母发酵培养基，灭菌，接种后，通过流加甘油培养的方式，迅速积累毕赤酵母的菌体量；甘油培养阶段结束后，将毕赤酵母饥饿30min左右进入甲醇诱导阶段，甲醇通过补料的方式流加进入发酵罐中，直至外源蛋白表达量达到峰值时，结束诱导，常规发酵阶段结束；
[0026]以上所述的方案中，优选的，所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母MMpk-GSl 15 (Pichia pastoris MMpk-GSl 15)，保藏编号为:CCTCC Ν0:Μ 2014171。
[0027]本发明的保护内容还包括一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法在降低发酵成本中的应用；或在缩短发酵时长中的应用；或同时降低发酵的成本和缩短发酵的时长中的应用。
[0028]与现有技术相比，本发明的主要优点:
[0029](I)常规发酵方式，甘油培养阶段大概需要40h?45h，本发明在重复发酵阶段甘油培养仅需2h?8h，节省了甘油培养阶段的大量时间；
[0030](2)相较于常规方式，本发明在重复发酵阶段甘油的使用量为常规方式的三分之一左右，减少了甘油的使用量，降低了成本；
[0031](3)本发明在重复发酵阶段，菌体已经完全适应了甲醇，故在流加甲醇时，菌体可以直接利用甲醇，而不需要适应期，相较于常规方式大概能缩短Ih?3h的发酵时间。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体的实施例对发明做进一步的详细说明，但本发明的范围并不限于下述实施例。本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术。
[0033]实施例1:
[0034]本实施例以一株毕赤酵母工程菌巴斯德毕赤酵母MMpk-GSl 15 (Pichia pastorisMMpk-GS115)，保藏编号为:CCTCC Ν0:Μ 2014171为例进行说明。
[0035]常规发酵:
[0036]配制20L培养基倒入50L发酵罐中，以甘油为碳源进行分批发酵，再经过甘油补料发酵，碳源饥饿，然后进行甲醇补料发酵；其碳源饥饿时间为30min ;在碳源饥饿后向发酵罐中加入含有12ml/L微量盐溶液的甲醇。
[0037]具体过程包括:
[0038]配制发酵培养基，接种，以甘油为碳源进行分批发酵，发酵20?24h，当溶氧值迅速上升至100%时立即开始流加6L含有12ml/L微量盐溶液的质量比为50%的甘油，流加速度为24ml/min，当溶氧值再次迅速上升至100%时，表明流加的甘油已经消耗完，此时菌体湿重达到350g/L，从流加甘油到甘油全部消耗完大约需要20h。接着饥饿30min后开始流加含有12ml/L的微量盐溶液的甲醇，甲醇流加速度为4ml/min，开始流加甲醇的初期，菌体会有一段适应时间，一般在3h，在此时间里，菌体基本不利用或缓慢利用甲醇，甲醇流加72h，待溶氧值迅速上升至100%时，则表明流加进入罐中的甲醇已全部消耗完，即可下罐。
[0039]常规发酵过程发酵总时长约为125h，发酵液中蛋白酶的酶活为10.5XlOVmlο
[0040]以上常规发酵过程中，控制温度28.5±0.5°C，pH为5.0±0.1，ρΗ通过氨水流加调节，罐压0.04MPa，搅拌转速800rpm。
[0041]所述的发酵培养基配方为:26.7mL 85% (体积比)磷酸，0.93g硫酸钙，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，40g甘油，加水至总体积为1L。
[0042]所述的微量盐溶液的配方为:将6.0g五水硫酸铜，0.08g碘化钠，3.0g 一水合硫酸锰，0.2g 二水钼酸钠，0.02g硼酸，0.5g氯化钴，20.0g氯化锌，65.0g硫酸亚铁，0.2g生物素，5.0ml浓硫酸，加水至总体积为1L。
[0043]一种毕赤酵母菌体重复发酵表达外源蛋白的方法，包括以下步骤:
[0044]第一次重复发酵:
[0045](I)将常规发酵的发酵液，经管式离心机离心，转速为6000rpm，离心5