抗cd52抗体的制作方法
【专利说明】抗CD52抗体
[0001] 序列表
[0002] 本申请包含作为ASCII形式的文本文件以电子方式已经提交的序列表，且其在此 处以其全文通过提述并入。2014年3月11日生成的所述文件名称为001662-0041-W01_ SL. txt且大小为142, 582字节。 发明领域
[0003] 本发明一般地涉及抗体，且更具体地涉及对于人⑶52具有结合特异性的抗体。
[0004] 相关申请的交叉引用
[0005] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/794, 576的优先权。该临 时申请的公开内容在本文以其全文通过提述并入。
[0006] 发明背景
[0007] ⑶52是在多种正常和恶性类淋巴细胞（例如，T细胞和B细胞）上大量发现 的（500, 000分子/细胞）糖基化的、糖基磷脂酰肌醇（GPI)锚定的细胞表面蛋白。参 见，例如，Hale 等，J Biol Regul Homeost Agents 15:386-391(2001) ;Huh 等，Blood 92:Abstract 4199(1998) ;Elsner 等，Blood 88:4684-4693(1996) ;Gilleece 等，Blood 82:807-812(1993) ;Rodig 等，Clin Cancer Res 12:7174-7179(2006) ;Ginaldi 等，Leuk Res 22:185-191 (1998)。CD52在例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等髓样细胞上以较低 水平表达，其中在成熟自然杀伤（NK)细胞、嗜中性粒细胞和造血干细胞上发现几乎不表达 (同上）。总之，CD52存在于至少95%的所有人外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞中 (Hale G，等，"The CAMPATH-lantigen(CD52)，"Tissue Antigens, 35:178-327(1990)) 〇 ⑶52还由副睾和输精管中的上皮细胞产生，且在通过生殖道期间由精子获得（Hale 等，2001，见上文；Domagala 等，Med Sci Monit 7:325-331 (2001))。CD52 的确切生物 功能仍不清楚，但若干证据暗示其可能涉及T细胞迀移及共刺激（Rowan等，Int Immunol 7:69-77 (1995) ;Masuyama等，J Exp Med 189:979-989 (1999) ;Watanabe 等，Clin Tmmunol 120:247-259(2006))〇
[0008] 已开发数种抗CD52单克隆抗体。Campath-I(还称为阿仑单抗 (alemtuzumab)、Campath?、MabCampath? )是人源化抗人CD52单克隆抗体，其展现 强效的体外细胞毒性效应（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)和补体依赖性细胞毒 性（CDC))。阿仑单抗识别由成熟CD52蛋白羧基端四个氨基酸和带负电荷的GPI锚定部分 构成的表位。其他抗人CD52单克隆抗体也已产生。然而，在保存中和特定pH和温度条件 下，若干这些抗体的结合亲和力降低。因此，对于具有降低的经历该变化的倾向的抗CD52 抗体存在需求。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明的特征为经过工程化从而随着时间经过并且在高pH和温度条件下仍保持 结合亲和力的抗人CD52抗体。本文中的"抗体"和"免疫球蛋白"可互换使用。还提供包 含编码抗CD52抗体轻链或重链的序列的分离核酸、重组载体和宿主细胞，和制备抗CD52抗 体的方法。
[0011] Ab26是具有SEQ ID NO: 3减去信号序列的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 4减去信 号序列的轻链氨基酸序列的人源化抗人CD52单克隆抗体。Ab26在保存期间CD52的结合亲 和力和效力会随时间降低。我们意外发现在轻链CDRl位置11具有某些单一氨基酸取代的 Ab26变体（例如，单克隆抗体Ab21、Abl6和Ab20)，相比Ab26,其不仅保留或超越Ab26的 人⑶52结合亲和力，还展示显著改善的稳定性。所述变体抗体如Ab21、Abl6和Ab20相比 Ab26已展示体外及体内可比较或改善的生物学效力。这些变体可用于治疗及诊断应用。
[0012] 在一些实施方案中，本发明的抗人⑶52抗体或抗原结合片段包含重链可变区和 轻链可变区，其中所述重链可变区包含：SEQIDN0:7的重链⑶R1、SEQIDN0 :8的重链 CDR2;和SEQ ID N0:9的重链CDR3,且其中所述轻链可变区包含：SEQ ID N0:86的轻链 CDR1;SEQ ID N0:34的轻链CDR2;和SEQ ID N0:35的轻链CDR3。在进一步的实施方案中， SEQ ID N0:86 的残基 11 可为 1(、1?、〇、!1、3、￥、4、03、？、1、1^、]\^、1'或￥。在一个实施方案 中，SEQ ID N0:86的残基11是K。在另一实施方案中，SEQ ID N0:86的残基11是R。在另 一实施方案中，SEQ ID NO:86的残基11是Q。
[0013] 在一些实施方案中，抗⑶52抗体或片段的重链可变区包含SEQ ID N0:59。在另外 的实施方案中，抗CD52抗体或片段的轻链可变区包含选自SEQ ID N0:68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的序列。举例来说，本发明抗体或片段的重链和轻链分 别可包含：a) SEQ ID NO: 59 和 68 ;b) SEQ ID NO: 59 和 69 ;c) SEQ ID NO: 59 和 70 ;d) SEQ ID NO:59 和 71 ;e)SEQ ID NO:59 和 72 ;f)SEQ ID NO:59 和 73 ;g)SEQ ID NO:59 和 74 ;h)SEQ ID NO:59 和 75 ;i)SEQ ID NO:59 和 76 ;j)SEQ ID NO:59 和 77 ;k)SEQ ID NO:59 和 78 ;1) SEQ ID NO: 59 和 79 ;m) SEQ ID NO: 59 和 80 ;n) SEQ ID NO: 59 和 81 ;〇) SEQ ID NO: 59 和 82; 或 p)SEQ ID NO:59 和 83。
[0014] 在一些实施方案中，抗体或片段包含无信号序列的SEQ ID NO:3重链氨基酸序列。 在另外的实施方案中，抗体或片段包含选自SEQ ID N0:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57和58的轻链氨基酸序列。举例来说，抗体或片段可包含（a)无信号序列 的SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:49的轻链氨基酸序列；(b)无信号序列的 SEQ ID N0:3的重链氨基酸序列和SEQ ID N0:53的轻链氨基酸序列；或（c)无信号序列的 SEQ ID N0:3的重链氨基酸序列和SEQ ID N0:54的轻链氨基酸序列。
[0015] 在一些实施方案中，本发明抗体为免疫球蛋白G(IgG)。在另外的实施方案中，抗体 包含人Fc区（例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。本发明还涵盖本发明任何抗体的 抗原结合片段，其中所述片段选自scFv片段、Fv片段、Fab片段、F (ab'）2片段、微型抗体、 双抗体（diabody)、三抗体（triabody)和四抗体（tetrabody)。
[0016] 在一些实施方案中，本发明抗体是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体和抗 原结合片段是人源化的。本发明抗体或片段的重链C端的赖氨酸可任选地裂解。
[0017] 本发明还涉及包含编码抗体的重链或其抗原结合片段或轻链或其抗原结合片段 或两者的核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ ID N0:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133 或 134 的核苷酸序列。本发明还涵 盖包含该核酸分子的重组载体（例如，表达载体）。在一些实施方案中，本发明涵盖包含该 载体的分离的宿主细胞。
[0018] 本发明还涵盖产生本文描述的抗CD52抗体或片段或该抗体或片段的重链或轻链 的分离细胞系。在一些实施方案中，本发明涉及制备抗人CD52抗体或其抗原结合片段的方 法，其包括（1)在适于该抗体或片段表达的条件下保持本文所述的宿主细胞或细胞系；和 (2)回收所述抗体或片段。
[0019] 本发明涵盖包含本文所述的抗体或抗原结合片段和药物上可接受的媒剂 (vehicle)或载剂（carrier)的组合物。
[0020] 本发明涉及用于治疗对其有需要的患者的方法，其包括对所述患者施用有效量的 本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明涵盖用于治疗对其有需要的 患者中的自身免疫疾病（例如，多发性硬化症）的方法，其包括对该患者施用本文所述的 抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明涵盖用于治疗对其有需要患者中的癌症 (例如，慢性淋巴性白血病）的方法，其包括对该患者施用本文所述的抗体或抗原结合片 段。本发明还涉及抑制对其有需要患者中的血管生成的方法，其包括对该患者施用本文所 述的抗体或抗原结合片段。
[0021] 在一些实施方案中，本发明涉及使用本文所述的抗体或抗原结合片段治疗对其有 需要患者中的自身免疫疾病（例如，多发性硬化症），或制备其治疗药物的用途。本发明还 涉及使用本文所述的抗体或抗原结合片段治疗对其有需要患者中的癌症（例如，慢性淋巴 性白血病），或制备其治疗药物的用途。本发明进一步涉及使用本文所述的抗体或抗原结合 片段治疗对有需要患者中的过度血管生成，或制备用于抑制血管生成的药物的用途。
[0022] 附图简述
[0023] 本专利或申请文件含有至少一个彩色绘图。在请求和支付必要费用时，有关部门 将提供具彩色绘图的本专利或专利申请公开的副本。
[0024] 图1描绘抗CD52抗体的快速亲和力筛选结果。上图为制备抗体的流程图。中图 和下方表格显示BIAC0RE?结合分析和Octet表达水平测定的结果。
[0025] 图2描述表征纯化的抗⑶52抗体的实验结果。上图是显示抗⑶52抗体重链和 轻链分离的SDS-PAGE凝胶的照片。分子量标记示于标记的泳道（M)。下方的图和表显示 BIAC0RE?结合分析的结果。
[0026] 图3描述显示于CHO细胞中产生的Ab24和AblO抗体制剂的SDS-PAGE凝胶照片。 所述凝胶还显示对照的抗⑶52 (CTL)抗体和Abl抗体。箭头指出IOOkD物种及LC剪切。
[0027] 图4描述SDS-PAGE凝胶照片，其显示Ab24和Ab 10抗体中存在的IOOkD类型 (species)，其中在右侧显示了"仅重链"的二聚体。还显示N端测序结果。
[0028] 图5描述表征另外的抗CD52抗体的实验结果。表和图显示BIAC0RE?结合分析及 Octet表达水平测定的结果。"KGN"指具有SEQ ID NO: 3重链序列和SEQ ID NO: 2轻链序 列的抗CD52抗体。
[0029] 图6描述表征纯化抗⑶52抗体的⑶52结合的实验结果。左图为显示野生型（CTL) 和其他抗体的重链和轻链的SDS-PAGE凝胶照片。分子量标记示于标示的泳道（M)。右侧曲 线图显示BIAC0RE?结合分析的结果。
[0030] 图7为描述对照抗⑶52抗体和抗体Ab21、Ab 16和Ab20的⑶C分析结果图。
[0031] 图8描述在人⑶52转基因小鼠中，对照抗⑶52(CTL)抗体和抗体Ab21、Abl6和 Ab20的CD52+细胞消耗活性分析结果。左图显示血液样品的结果。右侧曲线图显示脾脏样 品的结果。
[0032] 图9显示野生型人⑶52蛋白的氨基酸序列（基因库（Genbank)登录编号 AAH00644. I)(SEQ ID N0:1))。
[0033] 图 10 显示抗体 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDN0:3) 的全长重链氨基酸序列，和抗体Ab26(SEQ ID NO :4)的全长轻链氨基酸序列。粗斜体为信 号序列，下划线为CDR。
[0034] 图 11 显示抗体 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDN0:5) 的全长重链核酸序列，以及抗体 Ab26、Ab I、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab 10、Ab 11、Ab 12、 Abl3、Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 KGN 的全 长轻链核酸序列。下划线为信号序列，粗体为开放阅读框。
[0035] 图 12 显示抗体 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的 H-CDRl(SEQ ID NO:7)、H-CDR2(SEQ ID NO:8)、H-CDR3(SEQ ID NO:9)、L-CDR2(SEQ ID NO: 34)和 L-CDR3(SEQ ID NO :35)的氨基酸序列。
[0036] 图 13 显示抗体 Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、Abl4、 Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 Ab26 的 L-CDRl 的氨 基酸序列。
[0037] 图 14 显示抗体 Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、Abl4、 Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的全长轻链氨基酸序 列。下划线为⑶R。
[0038] 图 15 显示抗体 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24 和 Ab25 的重链和轻链可 变结构域的氨基酸序列。下划线为CDR。
[0039] 图 16 显示抗体 Ab26、Abl、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、AblO、Abll、Abl2、Abl3、 Abl4、Abl5、Abl6、Abl7、Abl8、Abl9、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25 和 KGN 的重链可变 结构域和轻链可变结构域的核酸序列。
[0040] 图17描述表征从HEK293细胞纯化的Abl抗体的实验结果。图和表显示BIAC0RE? 分析测定Abl和两种Ab26制剂（CTLl和CTL2)对⑶52肽的亲和力结果。上右图是显示两 种Ab26制剂（CTLl和CTL2)和Abl抗体的重链（HC)和轻链（LC)的还原性SDS-PAGE凝胶 照片。
[0041] 图18描述表征从CHO细胞纯化的Abl抗体的实验结果。图显示BIAC0RE?分析测 定Abl抗体（下图）和Ab26抗体（CTL)(上图）对CD52肽的亲和力结果。
[0042] 图19为描述Abl抗体和Ab26抗体（对照）的⑶C分析结果的图。结果以相对荧 光单位（RFU)作为抗体最终浓度（单位为毫克/毫升）函数表示。
[0043] 图20描述抗⑶52抗体的稳定性筛选结果。上左图显示在45 °C和pH 7. 2就 Ab26 (CTL)和变体抗体而言，Kd (nM)作为时间（周）的函数。上右图显示45°C和pH 7. 2就 Ab26 (CTL)及变体抗体而言，相对于TO的亲和力作为时间（周）的函数。
[0044] 图21描述测试在三组分缓冲液中的温育对抗CD52抗体稳定性的影响的实验结 果。上左图显示两种Ab26制剂（CTLl和CTL2)和变体抗体在37°C和pH 7. 5于第0周、第 2周和第4周的Kd (nM)。上右图显示Ab26 (CTL)和变体抗体在45 °C和pH 7. 4于第0周、第 2周和第4周的KD(nM)。
[0045] 图 22 描述 Ab26 (CTL)、Ab21、Abl6 和 Ab20 在 45°C温育后尺寸排阻层析（SEC) -HPLC 分析的结果。
[0046] 发明详述
[0047] 本发明基于我们发现特定抗CD52抗体在特定pH和温度条件下或在保存期间随时 间丧失稳定性并展示降低的结合亲和力。我们已生成在亲源抗体的轻链CDRl (L-CDRl)单 一位置（位置11)包含氨基酸取代的变体抗体。我们已发现一些这样的变体抗体相比亲源 抗体不仅展示相似或改善的抗原结合特性和生物活性（包括体内效价），还展示增强的稳 定性。
[0048] 本发明包含抗人CD52抗体、所述抗体的抗原结合片段（即部分）、所述抗体的轻 链、所述抗体的重链和这些轻链或重链的片段。本发明涉及成熟抗体及其链（例如，糖基化 抗体），以及未成熟或前体抗体蛋白。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白两者的核酸 分子（例如，载体），包含此类核酸的宿主细胞，生产未成熟和成熟蛋白的方法，及使用该抗 体的方法。
[0049] 本发明的抗体和抗原结合部分可用于治疗对其有需要的受试者（例如，人患者） 的各种由具有CD52的细胞介导或引起的疾病和症状，例如一些免疫介导的疾病（ηω)征 兆。作用机制可能为抗⑶52抗体通过引起细胞死亡而消耗这些细胞（例如，淋巴细胞或癌 性⑶52+细胞）。举例来说，所述抗体可经由淋巴细胞消耗（一种经由减小循环性淋巴细胞 群（例如，T细胞和/或B细胞）导致淋巴细胞减少获得的免疫抑制类型）以治疗自身免 疫疾病（例如，多发性硬化症（MS)、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、血管炎、肌炎和韦格 纳氏疾病（Wegener's disease))。本发明抗体还可用于治疗癌症，例如，白血病（例如，慢 性淋巴性白血病）和淋巴瘤（例如，非霍奇金氏淋巴瘤）；或用于组织移植（例如，实质器 官移植（例如，肾移植）和干细胞移植）。本发明抗体还可用于富集造血干细胞，例如，在离 体应用中（参见，例如，Lim 等，J. Hematology&Oncologyl: 19 (2008)) 〇
[0050] 本发_抗体的抗原结合件质
[0051] 本发明抗体对于人CD52或其