玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种玉米抗禾谷镶刀菌茎腐病基因ZmAuxRPl 的克隆及功能分析。
【背景技术】
[0002] 玉米狂eamaysL.)是粮饲兼用的重要粮食作物，也是重要的工业原料。玉米是 世界第一大作物，我国玉米2007年种植面积超过水稻，2010年总产超过水稻，也成为我国 名副其实的第一大粮食作物，我国粮食安全保障体系中占有举足轻重的地位。
[0003] 玉米茎腐病是玉米生产中危害严重的±传性病害，在很多国家与地区都有发生， 如南非、印度、加拿大、美国、英国、亚洲的尼泊尔与菲律宾及澳大利亚等。玉米茎腐病对 玉米产量造成极大影响，英国有报道称，在1973-1975年间，茎腐病引起的玉米产量损失为 11.2%。在美国的伊利诺伊州，炭痘茎腐病所造成的产量损失曾达到17. 2%。在我国，玉 米茎腐病最早开始报道于1962年，70年代W后报道逐步增多。80年代W来，玉米茎腐病在 我国发生日益严重，一般年份发病率为5-10%，严重年份为20-30%。80年代末到90年代 初，黑龙江省玉米茎腐病的田间发病率约10-20%，严重地块达50-60 %W上，产量损失达 10-20%。2004年豫西地区玉米茎腐病爆发，发病率平均在26 %W上，严重地块达100%。 山西玉米产区自80年代W来，一般发病率为10-20 %，严重的高达50 %W上。由于玉米茎 腐病性状极为复杂，受环境影响很大，从而导致抗性测定的误差增大，因此，开展对玉米茎 腐病的遗传基础研究相当困难。鉴于玉米茎腐病对经济和生态都有很重要的影响，培育抗 病品种成为控制病害流行的有效手段，可W将多个抗茎腐病的'L导入优良的自交系改良品 种抗性。
[0004] 目前，世界上许多国家都已经报道玉米茎腐病的致病菌，运些致病菌不尽相同，在 不同地区呈现不同优势病原菌。美国学者早期认为，玉米干腐菌值iplodiamaydis)与禾 谷镶刀菌（化sariumgraminearum)是引起玉米茎腐病发生的主要病原菌；但是到了20世 纪80年代至90年代间，炭痘病原菌逐渐发展成为了玉米茎腐病的主要病原菌。欧洲则多 W镶刀菌属病原菌(J'usariumspp)为主要致病菌，但是在法国西南部则是W玉米穗粒干腐 菌值iphodiazeae)作为主要致病菌。在我国，目前报道的玉米茎腐病的主要致病菌包括 禾谷镶刀菌（Fusarium邑ramine曰rum)、串珠镶刀菌（Fus曰riumverticillioides)、禾生腐 霉菌（P}fthiumgraminicola)、肿囊腐霉菌（P}fthiuminflatum)和瓜果腐霉菌（P}fthium aphanidermatum)等五大类。然而，运些病原菌在不同地区，不同年份都会发生变化。山 东省一般认为是串珠镶抱、禾谷镶抱或瓜果腐霉为主要致病菌；广西、湖北、山西等=省则 认为串珠镶刀菌是茎腐病主要病原菌；东北=省认为禾谷镶刀菌、串珠镶刀菌、腐皮镶刀菌 (Sariumsoiani)是主要致病菌；新疆地区的茎腐病病原菌主要是肿囊腐霉菌。一般来说， 镶刀菌茎腐病主要发生在气候偏干旱地区，而腐霉菌茎腐病主要发生在气候偏湿润地区。
[0005] 玉米抗茎腐病的遗传机制有两种不同的观点：一些学者认为玉米自交系对茎腐病 的抗性受环境影响，呈现数量性状的变化；在分离后代，表型呈现连续性变化，说明玉米茎 腐病受到多基因与多基因互作的共同调控。Kappelman和化ompson(1966)研究结果表明， 玉米对茎腐病的抗性受少数基因控制，加性效应和显性效应均起作用。Carson与化Oker认 为玉米对茎腐病的抗性是受多基因控制的。1993年，P6等利用高抗茎腐病自交系B87和 高感自交系33-16组配了 150个F2 :3家系，接种禾谷镶刀菌后对性状进行鉴定和分析，定 位了 5个抗禾谷镶刀菌茎腐病的giL位点，分别位于第1、3、4、5和10号染色体上。玉米抗 炭痘茎腐病的主效QTL(Rcgl)被定位到第4号染色体长臂上，该基因目前已经被成功克隆。 扬琴等利用高抗玉米茎腐病自交系1145和高感自交系黄331组配后代群体，经接种禾谷镶 刀菌后进行性状鉴定及分析，定位了2个giL位点，分别位于1和10号染色体上。
[0006] 另外，对于玉米茎腐病也有研究者认为是受的主基因调控的。Ba化-Apraku等人 研究认为玉米自交系LB31对炭痘茎腐病具有高抗性，而运种抗性是受到单基因调控的。其 后，在国内先后有人将茎腐病的主基因定位。2001年，Yang等同样利用高抗玉米1145自交 系与高感玉米Y331自交系组配分离群体，通过接种肿囊腐霉菌进行病症的鉴定，结果发现 其表型符合3:1的比例，而认为其抗病性受一对显示基因调控，并将其定位在4号染色体分 子标记bnlgl937和agrr286之间，其遗传距离为5. 7cM。事实上，对于不同茎腐病遗传抗性 的鉴定，无论是受多基因调控还是受单基因调控都只能在特定的病原菌及特定的群体的情 况下进行。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供玉米抗禾谷镶刀菌茎腐病基因ZmAuxRPl的克隆。
[000引本发明提供的蛋白质，命名为是ZmAuxRPl,如下a)或b)的蛋白质：
[0009]a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
[0011] 编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
[001引 上述DNA分子为如下1)-4)中任一种的DNA分子：
[001引 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0014] 2)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
[001引如与1)或。限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99 %同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
[001引 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。
[0017] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0018] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也是本 发明保护的范围。
[0019] 上述蛋白质或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或 重组病毒在调控植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围；
[0020] 或上述蛋白质或上述DM分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌 或重组病毒在培育高抗病转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0021] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0022] 所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镶刀菌；
[0023] 或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为玉米。
[0024] 抑制上述蛋白表达的物质在调控植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围。
[0025] 上述应用中，上述抑制上述蛋白表达的物质为如下1)或2)或3) :1)序列2第 1158-1367位核巧酸所示的DNA片段编码的RNA;2)序列2第1158-1367位核巧酸所示的 DNA片段；3)含有序列2第1158-1367位核巧酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达 载体。所述2)为pGreen-HY104-ZmAuxRPlRNAi，其为将序列2第1158-1367位核巧酸所示 的DNA片段替换载体pGreen-HY104的化Ol和EcoRI酶切位点间的DNA片段，且将序列2 第1158-1367位核巧酸所示的DNA片段的反向互补片段替换载体pGreen-HY104的BamHI 和PstI酶切位点间的DNA片段，得到的载体pGreen-HY104-ZmAuxRPlRNA，在导入植物中所 产生的RNA，进而所形成双链RNA。
[0026] 所述调控植物抗病性为提高植物抗病性；
[0027] 所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镶刀菌病；
[0028] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植 物为玉米。
[0029]本发明另一个目的是提供一种培育高抗病性转基因植物的方法。
[0030] 本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中上述蛋白表达，得到转基因植 物；
[0031] 所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。
[0032] 上述方法中，所述抑制目的植物中上述蛋白表达为将抑制上述蛋白表达的物质导 入目的植物；
[0033] 上述抑制上述蛋白表达的物质为如下1)或2)或3) :1)序列2第1158-1367位核 巧酸所示的DNA片段编码的RNA;2)序列2第1158-1367位核巧酸所示的DNA片段；3)含 有序列2第1158-1367位核巧酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达载体。所述2) 为pGreen-HY104-ZmAuxRPlRNAi，其为将序列2第1158-1367位核巧酸所示的DNA片段替换 载体pGreen-HY104的化Ol和EcoRI酶切位点间的DNA片段，且将序列2第1158-1367位 核巧酸所示的DNA片段的反向互补片段替换载体pGreen-HY104的BamHI和PstI酶切位点 间的DNA片段，得到的载体pGreen-HY104-ZmAuxRPlRNA，在导入植物中所产生的RNA，进而 所形成双链RNA。
[0034] 所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镶刀菌；
[0035] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0036] 或所述目的植物为单子叶植物，所述单子叶植物为玉米。
[0037] 本发明的实验证明，本发明发现新基因ZmAuxRPl,并通过干扰野生型玉米中的 ZmAuxRPl基因表达，得到转基因玉米，其与未干扰的野生型ZmAuxRPl相比，抗玉米茎腐病 性提高；并通过过表达实验，进一步证明，因此，干扰ZmAuxRPl基因表达可用于水稻抗玉米 茎腐病性。
【附图说明】
[0038] 图1为定位群体构建的图谱。
[0039]图 2 为RNAi干扰载体pGreen-HY104-ZmAuxRPl示意图。
[0040] 图3为过表达载体pGreen-0229-ZmAuxRPl不意图；
[0041] 图4为精细定位结果；
[0042]A:2008年，15个BC4F1交换单株共983株BCsFi群体，Q化-qRfg2被定位在SSRZ68/ SSRZ93 之间；