一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床基因治疗，尤其设及一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工 艺方法。
【背景技术】
[0002] 慢病毒是由人类免疫缺陷病毒（HIV)，通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基 因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒（vesicularstomatitisvi;rus)G 糖蛋白（VSV-G)来代替HIV-I的包膜进行包装，从而更安全，宿主范围更广，还能增加病毒 的滴度。目前，基因治疗已经被广泛用于治疗囊性纤维化、血友病、肌营养不良症和镶状细 胞贫血等基因遗传性疾病、血液病，W及肿瘤疾病当中。
[0003] 在基因治疗的环节中，早期应用的是腺病毒载体和逆转录病毒载体，但腺病毒不 能整合至宿主细胞，且免疫原性高，逆转录病毒只能感染分裂细胞。慢病毒载体不仅能感染 分裂细胞，也能感染静止期细胞，并且能稳定整合至宿主细胞，实现长期表达。在造血干细 胞移植治疗应用方面，慢病毒由于能感染大部分处于静止期的造血干细胞，已经成为一种 有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具，因此慢病毒载体将能广泛地应用于基因治疗领 域。
[0004] 用于基因治疗的病毒载体在纯度及滴度方面有极高的要求，通常在慢病毒载体的 生产制备过程中，收集的慢病毒原液含有培养基残留、包装质粒残留、包装细胞残留等成 分，而且滴度仅能达到IX1〇7化/mU实验室小量制备慢病毒一般采用高速离屯、或超滤浓 缩管方法，但运些方法处理量小，不适合大规模制备，且运些简单方法制备的慢病毒纯度和 滴度远不能满足基因治疗制剂要求，因此，为解决运个难题，需要开发一种新的慢病毒纯化 制备工艺，能够实现大规模制备高纯度，高滴度的慢病毒载体。为解决未来基因治疗中所需 的病毒载体提供了一种高效率的生产方案。
[0005]
【发明内容】
[0006] 为了解决W上技术问题，本发明提供了一种改良的大规模获得高纯度，高活性慢 病毒的工艺方法，包括W下几个步骤： 步骤A:收集慢病毒原液，过滤去除细胞碎片，澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱 上样。
[0007]步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化： 步骤C:将收集的初纯病毒液加入超滤系统样品杯，再通过凝胶过滤纯化柱纯化； 步骤D:用过滤除菌，取适量样品进行纯度检测，感染滴度检测。
[000引优选的，所述步骤A中，采用0. 8/0. 45ym囊式滤器。
[0009]优选的，所述步骤B中，包括： 步骤Bl:用水冲洗DEAEFF弱阴离屯、纯化柱； 步骤B2:再用上样缓冲液平衡该弱阴离纯化柱； 步骤B3:将澄清后的病毒原液上样； 步骤B4:用上样缓冲液冲洗该弱阴离纯化柱，直至基线平稳，W除非特异性结合的蛋 白； 步骤B5:用低盐洗脱液冲洗纯化柱，W去除非特异性结合的蛋白； 步骤B6:用洗脱液冲洗纯化柱，收集目的病毒，即为初纯病毒液； 步骤B7:用水和无水乙醇冲洗纯化柱。
[0010] 优选的，所述步骤C中，超滤系统样品杯中生物累转速为50转/分钟。
[0011] 优选的，所述步骤C中，凝胶过滤纯化柱纯化包括W下几个步骤： 步骤Cl:采用PBS缓冲液平衡凝胶过滤柱； 步骤C2:用浓缩后的样品上样，再用PBSBuffer冲洗，收集第一个分离峰。
[0012] 优选的，采用0. 22ymPVDF针头滤器过滤除菌。
[0013] 优选的，所述步骤B2和B4中的缓冲液为50mlTris-HCl,质量浓度为2%薦糖， pH=7. 5,步骤B5中缓冲液为50mlTris-肥1，150mM化Cl,质量浓度2%薦糖抑=7. 5,步骤 B6中，缓冲液为50mlTris-肥1，IM化Cl,质量浓度2%薦糖，pH=7. 5。
[0014]其中，50ml Tris-肥1，质量浓度为2%薦糖，pH=7. 5,是指：Tris-肥1占整 个所述缓冲液中浓度为50ml，pH=7. 5,薦糖占整个缓冲液的质量浓度为2% ;50ml 化is-肥l，150mM化Cl,质量浓度2%薦糖抑7. 5,是指化is-肥1占整个所述缓冲液中浓 度为50ml，pH=7. 5，化Cl占整个所述缓冲液的浓度为150mM;50ml Tris-肥1，SOOmM 化Cl,质量浓度2%薦糖，pH7. 5,是指化is-肥1占整个所述缓冲液中浓度为50ml，化Cl 占整个所述缓冲液的浓度为500mM，薦糖占整个缓冲液的质量浓度为2%; 优选的，所述步骤B1、B2、B7和B8的流速为3cm/min，所述步骤B3-B6的流速为3cm/ mi打O
[0015] 优选的，所述步骤Cl中的流速设为Iml/min。
[0016] 本发明的有益效果是：通过初级纯化和精细纯化工艺，获得高纯度慢病毒颗粒，纯 度达99%W上；可实现更高的浓缩倍数，从而达到更高的滴度；处理量大，可规模化生产；采 用改良的离子交换层析缓冲液，能保证终产物的高活性，减少纯化过程中慢病毒的失活。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1是本发明一种实施例的工艺流程示意图； 图2SDS-PAGE检测纯度，其中Ianel为不含薦糖缓冲液纯化的慢病毒样品，lane2为 含2%薦糖缓冲液纯化慢病毒样品。
[0019] 图3 :含2%薦糖缓冲液纯化的慢病毒样品感染肥K293细胞 图4 :不含薦糖缓冲液纯化慢病毒样品感染肥K293细胞 图5.western-blot检测P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白残留图，其中，Lanel, 3: 不含薦糖缓冲液纯化终产物；Lane2,4 :含2%薦糖缓冲液纯化终产物；A:pl7检测显色后 的化学发光图和相应的白光图；B:SV40IargeT显色后的化学发光图和相应的白光图。
[0020] 图 6SDS-PAGE检测纯度。
[0021] 图7慢病毒颗粒感染滴度检测。
[0022] 图8western-blot检测P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白残留；A为pl7检测显 色后的化学发光图和相应的白光图；B为SV40IargeT显色后的化学发光图和相应的白光 图。
[0023]
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明： 实施例1 :使用改良缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化，如图1所示： 步骤A:收集IL慢病毒原液，用0. 8/0. 45ym囊式滤器过滤去除细胞碎片，澄清后的样 品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
[00巧]步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化： 1 .先用200血d地2〇冲洗100血DEAEFF弱阴离子纯化柱，流速设为3cm/min。
[0026] 2.再用200血上样缓冲液（50mlTris-肥1，质量浓度2%薦糖，pH7. 5)平衡该 弱阴离纯化柱，流速设为3cm/min。
[0027] 3.将澄清后的病毒原液上样，流速设为2cm/min。
[0028] 4.用IL上样缓冲液（50mlTris-HCl，质量浓度2%薦糖，pH7. 5)冲洗该弱阴离 子纯化柱，直至基线平稳，W去除非特异性结合的蛋白，流速设为2cm/min。
[002引 5.用化低盐洗脱液（50mlTris-肥1，150mM化Cl,质量浓度2%薦糖，pH=7. 5) 冲洗纯化柱，W去除非特异性结合的蛋白，流速设为2cm/min。
[0030] 6.用 500ml洗脱液（50mlTris-肥 1，SOOmM化Cl,质量浓度 2%薦糖，pH=7. 5)冲 洗纯化柱，收集目的病毒，即为初纯病毒液，流速设为2cm/min。
[0031] 7.用ILd地2〇冲洗纯化柱，流速设为3cm/min。
[003引8.最后用IL20%的无水乙醇冲洗纯化柱，流速设为3cm/min。
[003引步骤C:超滤浓缩：将收集的50血初纯病毒液加入超滤系统（100KD)样品杯，生物 累转速设置为50转/分钟，期间更换两次PBS缓冲液，通过S-500皿凝胶过滤纯化柱纯 化： 1.先用240mlPBS缓冲液平衡凝胶过滤柱，流速设为Iml/min。
[0034] 2.用浓缩后的样品30血上样，再用PBSBuffer冲洗，流速设为Iml/min。
[003引 3.收集第一个分离峰，样品约IOmL,即浓缩100倍。
[003引步骤D:用0. 22umPVDF针头滤器过滤除菌，取适量样品进行纯度检测，感染滴度 检测，western-blot检测P17蛋白含量，western-blot检测SV40IargeT蛋白残留。
[0037] 实施例2:使用常规缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化 步骤A:收集IL慢病毒原液，用0.8/0. 45um囊式滤器过滤去除细胞碎片，澄清后的样 品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
[0038] 步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化： 1.先用200血d地2〇冲