卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中il-6表达的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及卷烟烟气毒理研究技术领域，具体设及一种卷烟烟气中芳香胺类化合 物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的检测方法。
【背景技术】
[0002] 慢性阻塞性肺病kbonic obstructive pulmonary disease, COPD)是世界范围 内一种发病率高、致残致死率高、且严重影响患者生活质量的疾病，同时会加重患者的经济 负担。
[0003] 在各种致病因素中，吸烟是最重要的环境危险因素。据统计，由吸烟所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，COPD是其中的慢性肺病之一。国外有80 %~90 %的COPD是 由吸烟引起的，我国约有72%的COPD是由吸烟引起的。
[0004] 大量研究证实，COPD气道炎症主要由中性粒细胞（PMN)、淋己细胞和巨隧细胞等 炎症细胞浸润并被激活后释放大量细胞因子和炎性介质所致，其中TNF-Q、比-6、IL-8是 参与COTO气道炎症的重要细胞因子。
[0005] IL-6是由体内多种细胞产生，具有多种生物学活性的细胞因子，正常情况下可调 节机体免疫应答，病理状态下可诱导全身性急性期反应物释放，引起组织免疫性病理损伤。 应用动物或人的气道上皮细胞，采用卷烟提取物或全烟气暴露模型均发现能显著诱导气道 上皮细胞中IL-6的表达。对吸烟者和非吸烟者的大规模临床研究发现，二者血液及肺泡灌 洗液中IL-6具有显著差异，推断IL-6在吸烟诱导的COTO过程中扮演重要角色。
[0006]卷烟烟气是多种化合物组成的复杂混合物，截止1988年（据Robeds，1988 Tobacco RepOTter报道）已经鉴定出烟气中的化学成分达5068种，其中1172种是烟草本 身就有的，另外3896种是烟气中独有的。美国健康基金会副董事长化霍夫曼博±列出卷 烟烟气中的44种主要有害成分，除焦油、烟碱和一氧化碳运些主要成分外，其他大致可分 为九类：①氨；②四种芳香胺③苯并巧；④八种醒酬类化合物；⑥氨氯酸；⑧屯种无机元素； ⑦屯种酪类化合物；⑨四种烟草特有亚硝胺；⑨其他挥发性有机成分。
[0007] 芳香胺类物质具有一定的致癌作用，目前尚无芳香胺类物质对肺部炎症的相关系 统研究。
【发明内容】
[000引本发明提供了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中各种芳香胺类物 质对人气道上皮细胞中IL-6表达的诱导作用。 阳009] -种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的检测方法，包 括：
[0010] 步骤1，WpGL6为质粒载体，构建含有比-6启动子的比-6-promotor-pGL6质粒；
[0011] 步骤2,将]X-G-promotor-pGLG质粒转染入人气道上皮细胞16皿E中，得到 比-G-promotor-p化6-16皿E细胞；
[0012] 步骤3,在比-6-promotor-p化6-16皿E细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合 物，作用至少48h;
[0013] 步骤4,对步骤3的作用产物进行巧光素酶活性检测，依据所得的巧光素酶活性， 得到上皮细胞中IL-6的诱导表达倍数。
[0014] 本发明选取人气道上皮细胞中IL-6启动子序列-630-+57作为祀标序列，利用PCR 扩增该序列，并克隆到具有巧光素酶报告基因和G418筛选标记的PGL6质粒中，将测序验证 正确的质粒转染入人气道上皮细胞16皿E中，将转染后的细胞与卷烟提取物相作用，获得 上皮细胞中IL-6的表达程度。
[0015] 作为优选，比-e-promotor-pGLe质粒的构建方法如下：
[0016] 步骤1-1、设计IL-6启动子-630-+57的引物序列如下：
[0017]上游引物为：5'-ATGGTACCTGGAGACGCGTTGAA-3'（序列如沈QIDNO:1 所示的DNA 序列）； 阳0化]下游引物为：5'-CGCTCGAGGGGAGATAGAGCTTC-3'（序列如沈QIDNO:2 所示的DNA序列）；
[0019] W人气道上皮细胞16皿E的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增比-6启动子序 列；
[0020] 步骤1-2、利用化nI和化〇1I双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用 T4DNA连接酶连接至少2地，得到比-6-promotor-pGL6质粒。
[0021] 作为优选，步骤1-1中PCR反应的条件如下：
[0022]
[0023] 变性、退火、延伸循环28~30次。
[0024] 作为优选，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。
[00巧]作为优选，利用Lipofectamine3000转染试剂将]X-G-promotor-pGLG质粒转染入 人气道上皮细胞16皿E中，然后采用G418筛选得到比-6-promotor-p化6-16皿E细胞。 阳0%] 作为优选，步骤3中，芳香胺类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16皿E产生 细胞毒性的最大量。
[0027] 本发明提供的检测方法，具有W下优点：
[0028] (1)由于卷烟烟气进入人体气道后主要作用细胞，本发明采用人气道上皮细胞作 为研究对象，更接近吸烟的实际状态。
[0029] 似特异性的选取人气道上皮细胞中比-6的启动子序列，使检测更加具有针对性 和特异性。
[0030] (3)建立]X-e-promotor-P化6-16皿E稳转细胞，不用反复瞬时转染质粒，使筛选 更加快速和经济。
[0031] (4)采用巧光素酶报告基因作为最终检测指标，灵敏度高。
【附图说明】
[0032] 图Ia表示1-氨基糞对16皿E的细胞毒作用；
[0033] 图化表示3-氨基联苯对16皿E的细胞毒作用；
[0034] 图2a表示1-氨基糞对16皿E中IL-6表达的诱导作用； W35] 图2b表示3-氨基联苯对16皿E中IL-6表达的诱导作用；
[0036] 图3为PGL6质粒图谱；
[0037] 图4表示卷烟提取物对人气道上皮细胞中IL-6的诱导作用。
【具体实施方式】 阳0測实施例1
[0039] 芳香胺类物质是卷烟主流烟气中的主要物质之一，主要有如1-氨基糞，2-氨基 糞，1-氨基联苯，3-氨基联苯等。为检测运些芳香胺类物质是否是吸烟导致肺部炎症的主 要化合物，对1-氨基糞和3-氨基联苯是否会诱导人气道上皮细胞中IL-6的表达进行检 ，包括W下步骤：
[0040] 步骤1，WpGL6为质粒载体，构建含有比-6启动子的比-6-promotor-pGL6质粒， 构建方法如下：
[0041] 步骤1-1、设计IL-6启动子-630-+57的引物序列如下：
[0042] 上游引物为：5，-ATGGTACCTGGAGACGCGTTGAA-3，；
[0043] 下游引物为：5 ' -CGCTCGAGGGGAGATAGAGCTTC-3，； W44] W人气道上皮细胞16皿E的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-6启动子序列。
[0045] PCR反应体系包括：
[0046] 模板（即1組BE总基因组DNA) IliL: 上游引物（1雌M) 1.5liL: 下游引物（IO^M) 1却L; 2XPC民bufferfbrKODFX 25}儿； 2mMClNTPs 10.吐； KODFX(I.OIJ/hL) U止； Autoclaved,distilledwater 10f.iL; 总体积 50咕。
[0047] PCR反应的条件如下：
[0048] 94C预变性 2min; 98'C变性 lOsec;- 62 'C退火 说旅C';' M巧础战. 68C延伸 90sec。一一 W例将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶，IlOVJOmin电泳分离后，得到的扩增条带中的目 的条带约680bp切下，用GelExtractionKitDNA纯化试剂盒进行纯化。
[0050] 步骤1-2、采用化nI和化〇1I双酶切纯化产物化，同时采用化nI和化〇1I双酶切2yg质粒载体pGL65h，再次纯化回收后，用T4DNA连接酶在16°C下连接2地。 阳051] 连接反应体系如下：
[0052] pGL6载体 1咕; PC按产物 ？曲； l〇xT4 缓冲液 l|iL; T4连接酶 IjiL; 总体积 10冲。 阳05引PCR产物与pGL6载