Ccdc59的激动剂在制备骨性关节炎药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体设及CCD巧9的激动剂在制备骨性关节炎药物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎（osteoarthritis,OA)是中老年人最常见的疾病之一，由于人群预期 寿命的延长，骨性关节炎的发病率也明显增高，尤其是肥胖的老年人群，60岁W上人群中， 50 %W上在X线上有骨性关节炎表现。其常见病理改变为软骨下骨硬化、关节周围骨寶形 成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障碍严重影响患者的生活质量。
[0003] 现有的骨性关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技 术、替代治疗和体重控制。治疗骨性关节炎中常用的药物包括非酱族抗炎药如阿司匹林、布 洛芬等；直接用于皮肤的局部疼痛缓解乳膏、橡胶和喷雾剂等。可进行手术W使骨表面重 建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法已被用于治疗疾病，但是它们对长期控制和预 防是无效的。近年来研究发现在骨性关节炎的发生、发展的过程中多种细胞因子参与其病 理过程并起到非常重要的作用。参与骨性关节炎的细胞因子主要分为分解代谢相关细胞因 子、合成代谢相关细胞因子、炎性因子及一氧化氮、类花生酸类物质等其他细胞因子。运些 祀标的发现为骨性关节炎的治疗提供了新思路。
[0004] 发明人对7例骨性关节炎滑膜组织及4例对照样本进行高通量测序，结合生物信 息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因CCD巧9,现有研究中并没有CCDC59和骨性关节炎 相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CCDC59在骨性关节炎组 织中低表达，其激动剂可用于制备治疗骨性关节炎药物。本发明提供了一种新的骨性关节 炎的治疗祀点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊断制剂，所述骨性关节炎诊断制剂检测 CCDC59基因和/或基因的表达产物。进一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表达产物 在骨性关节炎组织中低表达。
[0006] 进一步，所述骨性关节炎诊断制剂采用巧光定量PCR试剂盒、基因忍片、免疫方法 检测骨性关节炎组织中CCDC59基因的表达。优选的，所述的巧光定量PCR试剂盒中含有一 对特异性扩增CCDC59基因的引物；所述的基因忍片中包括与CCDC59基因的核酸序列杂交 的探针。更优选的，巧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测CCDC59基因的上游引物和下游 引物，上游引物序列为SEQIDNO. 1，下游引物序列为SEQIDNO. 2。
[0007] 进一步，所述的骨性关节炎的诊断制剂采用免疫方法检测骨性关节炎滑膜组织中 CCDC59基因的表达产物。优选的，所述免疫方法为化ISA检测和/或胶体金检测。进一步， 所述检测CCDC59蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市 售的CCDC59单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被CCDC59抗体的固 相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涂液，酶反应终止液等。 [000引进一步，所述检测CCDC59蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的CCDC59单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免 疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区 (T)喷点有抗CCDC59抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本发明的目的在于提供上述骨性关节炎诊断制剂在制备骨性关节炎诊断工具中 的应用。
[0010] 本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有促进CCD巧9 基因的转录或表达的试剂或化合物。进一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表达产物 在骨性关节炎组织中低表达。
[0011] 本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可W采用下述方法中的一种 和/或几种：激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导入促进分子 标志物转录或表达的载体。
[0012] 优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂中含有促进CCDC59基因的转录或表达的载 体和/或激活CCDC59基因的启动子和/或激活CCDC59基因表达的蛋白或因子。
[0013] 本发明的目的在于提供上述治疗骨性关节炎的制剂在制备骨性关节炎治疗药物 或试剂中的应用。
[0014] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因CCD巧9基因，进而通过分子生物学方法验证了CCD巧9基因与骨性关节炎的关系：CCD巧9 基因与骨性关节炎具有很好的相关性，可用于制备骨性关节炎辅助诊断制剂，具有重要的 临床应用价值。
[0015] 巧光定量PCR法是通过巧光染料或巧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可W对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。巧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0016] 基因忍片又称为DNA微阵列值NAmicroarray)，可分为S种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或CDNA片段，通常用同位素标记 的祀基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与巧光标记的祀基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核巧 酸探针阵列，与巧光标记的祀基因杂交进行检测。基因忍片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有W下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；=是可同时检测多种疾病。
[0017] 酶联免疫吸附实验巧LISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹屯、法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的化ISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HR巧或者碱性憐 酸酶（AF0。
[0018] 常用的免疫胶体金检测技术：（I)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，W银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涂后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体W条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方 便。
[0019] 本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测 基因CCD巧9,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO. 1，下游引物序 列为沈QIDNO. 2。
[0020] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[002。 进一步，上述巧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、巧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。
[0022] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0023] 本发明目的是提供了一种骨性关节炎蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 CCDC59蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0024] 本发明目的是提供了一种检测骨性关节炎的基因忍片，所述的基因忍片包括与 CCDC59基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0025] 图1Westernblot测定滑膜组织中C