一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因 与应用。
【背景技术】
[0002] 春、秋、冬季节，寒冷地区的植物经常处于零度以下的环境中，从而需要一系列分 子和生理上的适应，以减轻冻害对自身造成的损伤。面对全球气温升高导致的暖冬和极端 恶劣天气的频繁交替出现，全球每年因低温冻害对农作物造成的损失高达数千亿元。因此， 加强植物特别是在农业、畜牧业等方面有重要利用价值的植物（如农作物、牧草等）的抗寒 基因挖掘，并利用转基因技术将优质的抗寒基因资源用于改良重要农作物与畜牧草的抗寒 能力，是当前我国及世界农业与畜牧业所正在面对的重大问题与挑战。
[0003] 植物一般能耐零下短时低温影响的特性称为抗寒性，这一特性是植物在漫长的演 化过程中对逆境环境不断适应的结果。植物的耐寒性涉及复杂的分子机制与生理生化过 程，其中前者主要包括了ΑΒΑ依赖、ΑΒΑ不依赖共2种途径，后者则包括膜系统（质膜的"膜 质相变")、抗氧化系统（SOD，POD，CAT等）、细胞渗透调节物质（可溶性糖、脯氨酸等）和植 物生长调节物质（ABA，GA等）等多方面的适应过程。尽管多年来人们对植物响应低温胁迫 的过程机制进行大量研究，但由于植物本身应对外界环境变化的响应机制十分复杂，使得 植物在响应低温方面的许多重要问题仍需进一步探索。同时，由于植物在抗逆机制方面存 在很多相互交叉的途径，其复杂性使得利用传统杂交育种方法很难得到抗寒性特异增强的 品种。此外，对于优质抗寒基因的筛选获得也成为阻碍当前植物耐低温基因工程大规模应 用的重要因素。
[0004] 近年，随着高通量测序技术的快速发展与广泛应用，人们开始不断利用高通量测 序技术对特定胁迫处理的植物材料进行测序分析，以得到与特定胁迫处理密切相关的差异 表达基因，从而为发现胁迫应答途径中的新基因开拓了新的途径。随着对耐低温新基因的 持续发掘和进一步的功能验证，人们对于植物耐寒机制的了解得以拓展。随着现代基因工 程技术的持续进步，利用转基因技术改良植物的抗寒性，对于维护未来农业与畜牧业的高 产稳产和可持续发展具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与植物抗寒性相关的蛋白及其编码基因和应用。
[0006] 本发明所提供的蛋白质，名称为Lc3919,来源于羊草（Leymuschinensis(Trin.) Tzvel·)，是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐冷性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 其中，序列表中序列1由198个氨基酸残基组成。
[0010] 为了便于Lc3919蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋 白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0011] 表：标签的序列
[0012]
[0013] 上述（b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0014] 编码所述1x3919蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0015] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Lc3919蛋白的基因（命 名为Lc3919);所述Lc3919基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0020] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc3919蛋白的 DNA分子；
[0021] 5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Lc3919 蛋白的DNA分子。
[0022] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 %SDS和 1XSSC，0· 1 %SDS各洗膜一次。
[0023] 其中，序列2由967个核苷酸组成，第101-697位为编码序列，编码序列表中序列 1所示的蛋白质。
[0024] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
[0025] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0026] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 ?81121、？8丨1119、？041^142301、？041^141301-1]1^~或其它衍生植物表达载体。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加 工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使 用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、 组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin 启动子（pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境 筛选转化植株。
[0027] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述Lc3919基因转录的启动子可为35S启 动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子。
[0028] 更为具体的，所述重组表达载体可为如下两种中的任一种：
[0029] (1)在pMDC45载体的重组位点attRl和attR2间插入所述Lc3919基因得到的重 组质粒。
[0030] (2)在pK7WG2D载体的重组位点attRl和attR2间插入所述Lc3919基因得到的重 组质粒。
[0031] 所述表达盒由能够启动所述Lc3919基因表达的启动子，所述Lc3919基因，以及转 录终止序列组成。
[0032] 所述Lc3919蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如 下（al)或（a2)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0033] (al)调控植物的抗寒性；
[0034] (a2)选育抗寒性提高的植物品种。
[0035] 在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗寒性具体为提高植物的抗寒性。
[0036] 所述选育抗寒性提高的植物品种的方法，具体可包括如下步骤：将所述Lc3919蛋 白表达量较高的植株作为亲本进行杂交，从杂交后代中获得抗寒性高于亲本的植株。
[0037] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗寒性提高的转基因植物的方法。
[0038] 该方法包括将编码所述Lc3919蛋白的基因导入目的植物中得到转基因植物的步 骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗寒性提高。
[0039] 所述Lc3919蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述 Lc3919蛋白的基因（即Lc3919基因）是所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0040] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；
[0041] 2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；
[0042] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0043] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc3919蛋白的 DNA分子；
[0044]5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Lc3919 蛋白的DNA分子。
[0045] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 %SDS和 1XSSC，0· 1 %SDS各洗膜一次。
[0046] 所述Lc3919基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中， 得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显 微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或 组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0047] 所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。
[0048] 在本发明中，以上的所述抗寒体现为抗_8°C胁迫处理12小时。
[0049] 在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚（Col-Ο)。
[0050] 扩增所述Lc3919基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0051] 在本发明的一个实施例中，所述引物对具体为如下：
[0052] 5, -ATCCTTGCTCCAGAGTCCAGATAAT-3,；
[0053] 5' -TTGAGATAGTTCACCACTG-3'。
[0054] 本发明所提供的Lc3919可以调控植物抗寒冷胁迫能力，受低温胁迫诱导，可以参 与羊草对低温胁迫的响应，提高植物的抗冷，Lc3919及其编码基因对于培育抗寒性提高的 羊草及其他植物新品种具有重要实用价性。实验显示，经_8°C过夜寒冷胁迫后野生型拟南 芥植株存