一种新物种来源低分子肝素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新物种来源低分子肝素的制备方法，特别涉及一种利用牛来源 (牛肺、牛肠）和羊来源（羊肠）肝素制备低分子肝素的方法，属于原料药制备技术领域
【背景技术】
[0002] 肝素与低分子肝素同属于抗凝血糖胺聚糖类临床药物，低分子肝素是由肝素经物 理方法、化学方法或者酶解法制备而成的新型抗血栓药物。相对肝素而言，低分子肝素具有 更高的生物活性，更长的半衰期和更少的副作用，低分子肝素类药物现已成为抗血栓抗凝 药物的首选。肝素可从猪小肠、牛肺、牛肠、羊小肠等粘膜组织提取，肝素类临床药物历史上 主要由猪和牛作为肝素的物种来源，但由于上世纪80年代末"疯牛病"和"羊瘙痒病"的影 响，目前临床药用肝素类药物避免使用牛和羊来源的肝素作为原料而只采用猪来源肝素。 猪来源肝素的市场垄断已成为肝素类药物市场不稳定的主要潜在因素，一旦猪来源肝素出 现安全问题，无其他可替代物种来源，则肝素类抗凝药物市场将直接崩溃。且目前"疯牛病" 发病机制已研究确认为主要由朊病毒传染而导致，朊病毒已存在有效的灭活方法，并且"疯 牛病"的流行可得到有效控制。各国政府也通过药典明确规定肝素必须要进行无传染性病 毒存在的认证，即利用现有的各种先进的纯化技术已可保证牛和羊来源肝素的安全。
[0003] 全球每年屠宰大量的牛、羊，可会提供丰富的的牛、羊肝素资源。且随着老龄化时 代的到来，对低分子肝素类药物的需求量也将越来越大。因此将牛、羊作为低分子肝素类 药物新的物种来源已是大势所趋。美国RobertLinhardt教授实验室已对猪、牛和羊来源 的肝素对比研究，三种肝素的分子量、硫酸化程度、乙酰化程度以及生物活性都存在显著差 异。为进一步研究牛、羊肝素所制备的低分子肝素的药用价值，首先需以牛、羊肝素为原料 制备牛、羊低分子肝素，然后与市售低分子肝素标准品进行结构和活性差异的比较。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有低分子肝素类药物来源物种单一、制得的低分子肝素分子量仍然 较大的问题，提供一种新物种来源低分子肝素的制备方法。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明利用从牛、羊体内提取的肝素按照相关方法制备依诺肝素钠，并通过分别 与USP标准品进行结构与抗凝活性的比较，从而确定以上低分子肝素类药物的临床应用价 值。
[0007] 发明详述
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] -种新物种来源低分子肝素的制备方法，步骤如下：
[0010] (1)将由原料牛肺、牛肠和/或羊肠制备的肝素钠完全溶解于水中，加入苄索氯铵 溶液，苄索氯铵与肝素钠的质量比为2~4倍，固液分离，干燥，制得肝素苄索氯铵盐；
[0011] (2)将步骤（1)制得的肝素苄索氯铵盐溶解于二氯甲烷中，加入氯化苄，肝素苄索 氯铵盐与氯化苄的质量体积比为1~2,单位为g/mL，25~40°C搅拌反应12~20小时，降 温并加入等体积的质量浓度为8~10%的醋酸钠甲醇溶液，固液分离，干燥，制得肝素苄基 醋；
[0012] (3)将步骤（2)制得的肝素苄基酯溶于水中，在55~65°C条件下，加入氢氧化钠， 使氢氧化钠浓度为〇. 05~0. 1M，反应20~90分钟，降温至18~22°C，调pH至中性，加入 氯化钠使氯化钠质量浓度为8~10%，在加入反应液3~5倍体积的醇，固液分离，干燥，制 得依诺肝素钠粗品；
[0013] (4)将步骤⑶制得的依诺肝素钠粗品溶于水中，经纯化，干燥，制得依诺肝素钠。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，肝素钠与水的质量体积比为0. 1~0. 3,单 位：g/mL〇
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（1)~（3)中，固液分离为过滤或离心。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，肝素苄索氯铵盐与二氯甲烷的质量体积比 为1 : (2~5)，单位g/mL。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，肝素苄基酯与水的质量体积比为1 :(20~ 25)，单位g/mL。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，醇为甲醇或乙醇。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，纯化为超滤、醇沉或透析；优选的，透析膜分 子量为lkD。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，干燥为-50~-60°C冻干。
[0021] 有益效果
[0022] 本发明首次发现通过处理牛肺、牛肠和羊肠原料制备的肝素钠可以获得低分子肝 素，不仅解决了药物产业链原料来源单一的问题，而且由于制得的低分子肝素较现有低分 子肝素分子量更低，因此其生物活性更高，具有广阔的市场应用前景。
【附图说明】
[0023] 图1、依诺肝素钠高效液相凝胶渗透色谱图；
[0024] 图中：USP依诺标准品为分子量标准；
[0025] 猪肠依诺样品为对比例1制得的符合USP依诺标准品分子量标准的样品；
[0026] 牛肺依诺样品-1为对比例2制得的不符合USP依诺标准品分子量标准的样品；
[0027] 牛肺依诺样品-2为实施例1制得的符合USP依诺标准品分子量标准的样品；
[0028] 图2、样品牛肺依诺样品-2 (图上）与USP依诺标准品（图下）核磁Η谱比较；
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0030] 实施例和对比例中所述的原料牛肺制备的肝素钠实验室纯化得到
[0031] 对比例中所述的原料猪肠制备的肝素钠购自常山生化药业有限公司 [0032] 实施例1
[0033] -种新物种来源低分子肝素的制备方法，步骤如下：
[0034] (1)将由原料牛肺制备的肝素钠lg完全溶解于lOmL水中，缓慢滴加20%的苄索 氯铵溶液10mL，过滤，烘干，制得肝素苄索氯铵盐；
[0035] (2)将步骤（1)制得的肝素苄索氯铵盐2. 5g溶解于6mL二氯甲烷中，滴加2. 5mL 氯化苄，35°C搅拌反应15小时，降温并加入等体积的质量浓度为8%的醋酸钠甲醇溶液，过 滤，烘干，制得肝素苄基酯；
[0036] (3)将步骤（2)制得的lg肝素苄基酯溶于25mL水中，在60°C条件下，加入氢氧化 钠，使氢氧化钠浓度为〇. 07M，反应30分钟，降温至20°C，调pH至中性，加入氯化钠使氯化 钠质量浓度为10%，加入75mL的甲醇，过滤，干燥，制得依诺肝素钠粗品；
[0037] (4)将步骤⑶制得的依诺肝素钠粗品溶于水中，透析48小时后，经_60°C冻干， 制得牛肺依诺肝素钠，记为牛肺依诺样品-2。
[0038] 实施例2
[0039] -种新物种来源低分子肝素的制备方法，步骤如下：
[0040] (1)将由原料牛肠制备的肝素钠lg完全溶解于20mL水中，缓慢滴加20%的苄索 氯铵溶液15mL，过滤，烘干，制得肝素苄索氯铵盐；
[0041] (2)将步骤⑴制得的肝素苄索氯铵盐2. 5g溶解于10mL二氯甲烷中，滴加4mL氯 化苄，40°C搅拌反应12小时，降温并加入等体积的质量浓度为10%的醋酸钠甲醇溶液，过 滤，烘干，制得肝素苄基酯；
[0042] (3)将步骤（2)制得的lg肝素苄基酯溶于25mL水中，在55°C条件下，加入氢氧化 钠，使氢氧化钠浓度为〇. 1M，反应30分钟，降温至20°C，调pH至中性，加入氯化钠使氯化钠 质量浓度