>【具体实施方式】
[0028]为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，实施例中涉及的方法步骤和参数条件均是斑马鱼的胚胎细胞和尾鳍细胞最佳条件设置，是通过长时间多次实验验证得出的最佳条件，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0029]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0030]除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0031]实施例:
[0032]一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤:
[0033](1)分离斑马鱼尾鳍和胚胎成纤维细胞:取斑马鱼的尾鳍和体节前期胚胎置于75%酒精溶液中漂洗，漂洗时间控制在30s以下，然后放于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗多次，去除斑马鱼胚胎的膜和卵黄，将漂洗后的尾鳍和胚胎剪碎成组织块平铺于培养皿1中，添加少量含有双抗的磷酸盐缓冲液后置于28°C、5% C02饱和湿度培养箱中，当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养，48h后换液，当组织块迀出的成纤维细胞达到80 %时，经0.05%胰酶进行消化处理后过200目滤器去除组织块，得到斑马鱼的成纤维细胞计数传代，选取低于20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞和第2?5代处于对数增长期的胚胎成纤维细胞冻存备用；培养基A成分为:90%DMEM、10%胎牛血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素；
[0034](2)感染斑马鱼成纤维细胞:选择生长状况良好无支原体污染的293Τ细胞以2.5Χ 107密度接种于含有培养基Α的100mm培养皿2中，使其24h后细胞密度达到70% -80%，转染前0.5h将培养皿2中培养293T细胞的培养基A更换为新鲜预热的5mlOpt1-MEM Reduced-Serum Medium ;准备6个1.5ml的经高压灭菌的EP管(离心管)分成A、B两组，每组各3个EP管，向A组的每个EP管中加入476 μ 1预热的Opt1-MEMReduced-Serum Medium (转染时用的无血清培养基，能够提高转染效率)和24 μ 1 LTX，向Β组的每个ΕΡ管中加入464 μ 1预热的Opt1-MEM Reduced-Serum Medium，再向B组3个EP管中分别加入 9 μ g 的 Tet0-FUW-0SKM/FUW-M2rtTA/Tet0-FUW-GFP (TetO-FUff-GFP 是一个对照，带GFP绿色荧光标记，用来衡量目的质粒的转染效率以及目的病毒的感染效率)、6 μ gpSPAX2、3 μ g pMD2.G，然后往这3个EP管中分别都加入18 μ 1 PLUS混匀，将A组得到的3个EP管中的混合物分别与B组得到的3个EP管中的混合物两两混匀后得到3份混合物，静置5min后将这3份混合物依次滴入含有293T细胞的100mm培养皿2中，然后放置于37°C、5% C02饱和湿度培养箱中开始转染，转染12h后为293T细胞换液，在转染48h、72h后分别进行一次毒液的收集，毒液经0.45 μ m低温高速浓缩滤器过滤后添加8 μ g/ml聚凝胺(通过低温高速浓缩病毒液提高病毒滴度从而提高感染效率，解决了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的问题)，然后直接感染斑马鱼尾鳍成纤维细胞和胚胎成纤维细胞(如图1所示)，感染12h后换液，为了增加感染效率可以进行二次感染；培养基A成分为:90% DMEMU0%胎牛血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM β -巯基乙醇、1 %的青霉素/链霉素；
[0035](3)诱导斑马鱼成纤维细胞为iPS:参见图2的诱导流程，将感染后的斑马鱼成纤维细胞以1.5X104的密度重铺于35mm培养皿中计数传代，用添加D0X(2ug/mL)的诱导型培养基进行诱导，得到的斑马鱼尾鳍成纤维iPS和胚胎成纤维iPS参见图3，每天换液一次，诱导15天左右，感染后的细胞会出现典型的iPS克隆，克隆边界清晰，外形鼓起，核质比大，此时采用机械法或者0.25%胰酶消化挑取生长状况良好的克隆，单克隆接于含有iPS培养基的feeder或0.2%明胶上(克隆在明胶条件下比在feeder上生长快速，但易分化，需要及时将分化的克隆刮除，否则更多的克隆将会分化)，每5d用0.25%胰酶传代扩增并冻存于液氮中，经常观察克隆，及时进行传代培养，即可得到斑马鱼的诱导性多能干细胞。iPS可分化为成纤维拟胚体，参见图4。
[0036]—种可用于上述斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法的诱导型培养基的成分为:90% DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素、10ng/ml bFGF。
[0037]—种可用于上述斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法的iPS培养基的成分为:DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇、1%的青霉素 / 链霉素、10ng/ml bFGF、0.5yM PD0325901、0.5 μM ALK5inhibitorA-83-0U3 μΜ GSK3 0 inhibitor CHIR99021、1000U/ml LIF 的培养液。
[0038]斑马鱼iPS的鉴定:
[0039]斑马鱼尾鳍和胚胎成纤维细胞诱导后获得的iPS细胞进行碱性磷酸酶活性检测呈阳性，如图5 ;经免疫细胞荧光染色鉴定表明所得的斑马鱼胚胎iPS细胞表达Oct-4、SSEA-1、Nanog, Sox2 ;而斑马鱼尾鳍成纤维所得的斑马鱼胚胎iPS细胞只表达0ct_4，如图6 ;斑马鱼胚胎成纤维感染病毒后获得的iPS细胞能分化成具有内、中、外三胚层的类似早期三胚层胚胎的结构的拟胚体(拟胚体的形成是研究干细胞体外分化能力的指标)，且如图7所示，RT-PCR鉴定分析表明其具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能；这些鉴定结果都直接说明获得的斑马鱼iPS细胞是具有多能性的。
【主权项】
1.一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤:首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞；所述诱导是指用含有盐酸强力霉素的诱导型培养基对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导；所述传代培养是指用iPS培养基对挑克隆后的诱导性多能干细胞进行传代培养。2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述斑马鱼组织为斑马鱼成体尾鳍；所述斑马鱼胚胎为体节前期胚胎。3.根据权利要求1或2所述的诱导方法，其特征在于，所述经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括:取斑马鱼的尾鳍或胚胎置于酒精溶液中漂洗，然后放入含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗，将漂洗后的尾鳍或胚胎剪碎成组织块贴于含有双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中，然后置于饱和湿度培养箱中培养，当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养，48?72h后换液，当组织块迀出的成纤维细胞达到80?90%时，经胰酶进行消化处理后过滤除去组织块，将得到的斑马鱼成纤维细胞计数传代并冻存备用。4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述培养基A的成分为90%DMEM、10%胎牛血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇和1%的青霉素/链霉素。5.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述斑马鱼成纤维细胞计数传代是取第2?20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞或第2?5代处于对数增长期的斑马鱼胚胎成纤维细胞。6.根据权利要求1?5中任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述用病毒感染斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括:将293Τ细胞接种于含有培养基Α的培养皿中，按9 μ gTetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP、6 μ g pSPAX2、3 μ g pMD2.G 添加质粒，按照转染操作处理后放置于饱和湿度培养箱中转染，转染至少48h后进行病毒液的收集，病毒液经低温高速浓缩滤器过滤后添加入聚凝胺，然后将含有聚凝胺的病毒液感染斑马鱼成纤维细胞；所述培养基A的成分为90% DMEM、10%胎牛血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇和1%的青霉素/链霉素。7.根据权利要求1?6中任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导的具体操作包括:将感染后的斑马鱼成纤维细胞重铺于培养皿中计数传代，用添加盐酸强力霉素的诱导型培养基进行诱导，诱导15?20d后细胞出现典型的诱导性多能干细胞克隆，此时采用机械法或者胰酶消化挑取生长状况良好的克隆消化成单细胞，然后接种于含有iPS培养基的feeder或明胶上，用胰酶传代扩增并冻存得到斑马鱼诱导性多能干细胞。8.一种可用于如权利要求1-7中任一项所述诱导方法的诱导型培养基，其特征在于，包括以下成分:90%DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素和10ng/ml bFGF ;所述诱导型培养基中添加有盐酸强力霉素。9.根据权利要求8所述的诱导性培养基，所述盐酸强力霉素的浓度为2?4ug/mL。10.一种可用于如权利要求1-7中任一项所述诱导方法的iPS培养基，其特征在于，包括以下成分:90% DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、ImM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸 0.ΙπιΜβ-巯基乙醇、1% 的青霉素 / 链霉素、10ng/ml bFGF.0.5μΜ PD032590U0.5 μ ΜALK5inhibitor Α-83_01、3μΜ GSK3 β inhibitor CHIR99021 和 1000U/ml LIFo
【专利摘要】本发明公开了一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞。基于同一个技术方案，同时还公开了用于该诱导方法的诱导型培养基和iPS培养基。RT-PCR分析表明，经本发明的胚胎成纤维诱导的iPS细胞具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。本发明攻克了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的技术难点，为斑马鱼体细胞重编程机制研究提供了新的工具细胞来源以及新的思路来选择细胞材料。
【IPC分类】C12N5/0735
【公开号】CN105238742
【申请号】CN201510801442
【发明人】肖亚梅, 周勇华, 赵小阳, 蒋明贵
【申请人】湖南师范大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月19日