多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法。
【背景技术】
[0002]多粘芽抱杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，是芽抱杆菌科(Bacillace-ae)类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的革兰氏阳性细菌，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的细胞呈直杆状，菌落多呈浅黄色或白色，隆起，粘稠状，表面湿润光滑。利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆型芽孢；最适生长pH值为7.0，最适温度为28-30°C，兼性厌氧，分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色素。
[0003]多粘芽孢杆菌是被美国环境保护署列为可商业应用的微生物种类之一，目前报道该菌广泛用于农业、医药、工业等方面。在工业方面主要应用于酶制剂的生产，在农业中的应用主要有两个方面:其中最主要的一方面是它可以防治多种由卵菌、真菌、细菌、线虫引起的植物病害，另一方面是它可以促进植物生长。据目前研究来看，多粘芽孢杆菌能够防治玉米叶斑病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、黄瓜灰霉病菌等19种病原真菌和番茄青枯病菌、大白菜软腐病菌等两种病原细菌的生长。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明提供的多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法，包括多粘芽孢杆菌菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备以及固体发酵的步骤。
[0006]其中，用于固体发酵生产多粘芽孢杆菌孢子的固体发酵培养基，包括如下重量份的各组分:玉米秸杆粉2-4.5、豆柏粉2-4.5和0.5%氯化钠溶液4_6。所述玉米秸杆粉的细度为20目。
[0007]液体补料培养基为:蔗糖5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锰5g/L、硫酸锰5g/L。以水配制。
[0008]优选地，用于固体发酵生产多粘芽孢杆菌孢子的固体发酵培养基，包括如下重量份的各组分:玉米秸杆粉2.5、豆柏粉2.5和0.5%氯化钠溶液5。
[0009]固体发酵的方法为:
[0010]将二级液体种子液按15% -20%的接种量接种至固体发酵培养基中，于浅盘发酵设备中35°C，通气量2.5L/min，相对湿度85%以上的条件下，培养1.5-2.5天，然后进行培养基补充，即向固体发酵培养基上喷洒液体补料培养基，继续培养，待产孢量达到85 %以上时，提高培养温度至45°C，继续培养6h后取出培养物。
[0011]优选地，进行培养基补充时，向固体发酵培养基上喷洒液体补料培养基，补料的比例为1:4干物质量计(即向固体发酵培养基上喷洒相当于其质量25%的液体补料培养基)，继续培养2-2.5天，待产孢量达到85%以上时，提高培养温度至45°C，继续培养6h后取出培养物，干燥至水分含量为8%以下。
[0012]前述方法中，一级液体种子液的制备方法为:将活化后的多粘芽孢杆菌挑2-3环菌种接种至肉汤培养基中(1000ml三角瓶，装液量为400ml，121 °C高压灭菌15min)，于35°C，200r/min的条件下发酵20h，发酵过程中控制pH值7.0，即得一级液体种子液。
[0013]前述方法中，二级液体种子液的制备方法为:将一级液体种子液按10 %的接种量接种至肉汤培养基中，于发酵罐中，35°C，180r/min，通气量3L/min条件下，发酵培养18h，即得二级液体种子液。
[0014]本发明还提供一种制备多粘芽孢杆菌孢子粉的方法，按照上述多粘芽孢杆菌孢子的生产方法，固体发酵培养结束后，将发酵基质干燥(例如50°C )后粉碎，即得多粘芽孢杆菌孢子粉。
[0015]本发明中用于发酵生产多粘芽孢杆菌孢子的多粘芽孢杆菌菌株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，保藏编号为10122。
[0016]本发明提供了一种多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法，多粘芽孢杆菌经菌种活化，一级液体种子液的制备和二级液体种子液的制备，再采用固体发酵方法发酵产生孢子。所述固体发酵使用的固体发酵培养基由玉米秸杆粉、豆柏粉和无机盐(氯化钠)组成，固体发酵过程中向培养基上喷洒补料培养基。采用本发明提供的多粘芽孢杆菌固体发酵产孢的方法，可产生大量的孢子，基质孢子量最高可达279 X 108cfu/g,发酵单位高，生产过程不产生废料，环保无污染。发酵所获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于农作物的生防。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0018]本发明中涉及到的百分号“ ，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
[0019]以下实施例中培养基配方涉及的“份”是指重量份。液体补料培养基为:鹿糖5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锰5g/L、硫酸锰5g/L，以水配制。
[0020]实施例1固体发酵生产多粘芽孢杆菌孢子
[0021]包括以下步骤:
[0022]1、斜面种子的制备
[0023]将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的保藏编号为10122的多粘芽孢杆菌菌种在营养琼脂试管斜面上活化。
[0024]2、一级液体种子液的制备
[0025]将活化后的多粘芽孢杆菌挑2-3环菌种接种至肉汤培养基中(1000ml三角瓶，装液量为400ml，121°C高压灭菌15min)，于35°C，200r/min的条件下发酵20h，发酵过程中控制pH值7.0，即得一级液体种子液。
[0026]3、二级液体种子液的制备
[0027]将一级液体种子液按10% (v/v)的接种量接种至肉汤培养基中，于35°C，180r/min，通气量3L/min条件下，发酵培养18h，得到二级液体种子液。
[0028]4、固体发酵
[0029]将二级液体种子液按20% (种子液/固体培养基)的接种量接种至固体发酵培养基中，于浅盘发酵设备中35°C，培养期间通入无菌空气，通气量2.5L/min，相对湿度85%以上的条件下，培养2天后用灭菌的喷洒壶向固体发酵培养基上喷洒补加经灭菌的液体补料培养基，补料的比例为1:4干物质量计。继续培养2.5天，镜检产孢量达到85%以上，提高培养箱温度至45°C，继续培养6小时后取出培养物，干燥至水分含量为8%以下。
[0030]每天对发酵盘取样镜检，如有杂菌感染则取出灭菌后丢弃。
[0031]用于固体发酵生产多粘芽孢杆菌孢子的固体发酵培养基配方为:玉米秸杆粉(细度为20目)2.5份、豆柏粉2.5份和0.5%氯化钠溶液5份。将配制好