一种红花dna条形码标准基因序列的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设物种鉴定领域，具体地说是一种红花物种特异性的基因序列，W及基于 该基因序列的特异性引物组合，用于特异地检测红花成分。
【背景技术】
[0002] 红花（学名：Ca;rthamustinctorius，英文名称：Safflower)为菊科红花属一年或 两年生草本植物，别名草红花、刺红花、蓝红花、杜红花等。谈起红花，人们很容易将红花与 藏红花混淆，藏红花（又名番红花、西红花）是尊尾科番红花属（化OCUS)植物，二者有本质 区别。红花原产埃及、印度和地中海沿岸等地区，苏联有野生也有栽培，朝鲜、日本广W栽 培，现W印度、加拿大、美国、澳大利亚等十多个国家产量较多，红花是近年来国外发展较快 的新型油料经济作物。目前红花在我国二十多个省都有分布，如新疆、甘肃、云南、河南、四 川、安徽、浙江、陕西、江苏、福建、山东、西藏、河北、湖北、天津、迂宁、吉林、黑龙江等省均有 栽培，适应范围广。
[0003] 红花在中国已有两千多年的栽培和药用历史，早在汉代就有引种记载，是一种集 药材、油料、饲料为一体的经济作物。W其花入药，具破疲活血、通经止痛、消肿等功效，近 年来被广泛用于各类屯、血管病；其种子可棒油，红花巧油是优质的食用油，被营养界公认为 "亚油酸王"（含量高达85% )。炼油后的饼巧可W当畜禽饲料，其饼巧含蛋白质高达19~ 36%，作饲料喂养奶牛，能增加牛乳中脂肪与亚油酸的含量；花可提取优良的天然食用色 素；红花的花粉也可食用。
[0004] 对于多组分的农产品和中药，经过加工后，通过外观通常难W辨别。市场上很多不 法商贩为了获取高额利润，经常W低价值的产品混入或冒充高价值的产品。红花作为一种 具有重要的经济价值的作物，建立一种可W特异地检测红花成分的方法，有助于红花成分 的鉴定，防止按假使杂。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是提供红花DNA条形码标准检测基因及其检测方法，W该基因序列为检测祀标，筛选出可W特异地鉴定红花的引物组合，用于特异地检测红花成 分。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取W下技术方案：
[0007] -种红花物种特异性检测基因，其特征在于所述基因序列为下述的基因序列：
[0008]ttgcgtagatggaggcgtgatcttattccaccacagtggttaccggcaagagttagatat 60
[0009]ggtg曰曰gttg曰cgttg曰曰曰曰gg曰曰曰ggttg曰tggc曰曰g曰gc曰tttgctgc 曰gtgg曰tcgt 120
[0010]曰t邑曰t曰邑邑tc邑t邑ttc邑t曰曰t邑曰邑曰曰邑邑曰t邑t邑tt曰邑曰邑c邑t邑tc邑tt邑曰邑 171〇
[001。 红花DNA条形码标准检测基因的PCR引物序列为：
[0012] 沈QIDNO. 2HHF1651:ttgcgtagatggaggcgtgat 21
[0013]沈QIDNO. 3HHR1822:ctcaacgacacgctctaacac 21。
[0014] 一种红花物种的分子鉴定方法，包括：
[001引1)从待测样品中提取DNA;
[0016] 2)W该DNA为模板用引物HHF1651和HHR1822通过聚合酶链式反应（Polymerase 化ainReaction,PCR)扩增出该基因。W无菌水为空白对照，W红花基因组DM为阳性对 昭. y>、、，
[0017] 3)然后取适量步骤2)的PCR扩增出的基因片段用琼脂糖凝胶电泳分离，经漠化乙 锭染色后置于凝胶成像系统中观察，当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符 的清晰、单一条带则说明PCR结果可靠；
[001引4)根据被测样品扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出171bp的条带， 即可判断所检测样品中含有红花成分。
[0019] 不同物种由于独立进化的结果，它们在遗传、生理和品质等方面各具特色。利用不 同物种特有的DNA序列可W开发成能够识别和定量不同物种及其加工产品的标记。本发明 是运样实现的：在GenBank中检索红花的基因序列，分析基因信息，优先选择具有完整序列 和信息的基因组序列和cDNA序列。然后将选择的序列进行Blastn分析，选择特异性强、相 似序列少的红花基因序列。W特异性强的基因序列为检测祀标，设计引物，进行PCR扩增分 析。最终筛选出来的引物组合具有W下特征：1、扩增条带清晰、单一；2、在所有的红花品种 中均有相同的扩增条带；3、在其他红花近缘种、常见的作物中均没有扩增。
[0020] 本发明提供了一种特异地检测红花成分的方法，有助于红花成分的鉴定，防止按 假使杂。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现红花的分子鉴 定，能有效缩短红花的鉴定时间。
[0021] 附图
[0022] 图1是基于本方法设计的引物组合HHF1651/HHR1822在红花CT0S-1基因 (AB047859)序列中的位置图；
[002引图2是HHF1651/HHR1822分别对23种不同红花品种的基因组DNA扩增结果图（泳 道Μ是天根化2000 DNA ladder,泳道1为水的空白对照，泳道2-24依次为库车无刺，西昌 红花，南涧红花，巧城红花，西安红花，巨野无刺，南溪红花，巨野红花，启东红花，郭陵红花， 乌鲁木齐无刺，乌鲁木齐少刺，乌鲁木齐有刺，吐鲁番无刺，吐鲁番少刺，吐鲁番有刺，哈密 有刺，哈密无刺，伊吾有刺，伊吾无刺，云红4381，云红4461，云红4462);
[0024]图3是HHF1651/HHR1822分别对红花和17种非红花品种的基因组DNA扩增结果 图（泳道Μ是天根化2000 DNA ladder,泳道1为水的空白对照，泳道2为红花，泳道3-19 依次为向日葵，大豆，玉米，棉花，番茄，小麦，大麦，班豆，胡萝l·，油菜，辣椒，花生，芝麻，萝 h水稻，烟草，拟南芥）；
[00巧]图4是HHF1651/HHR1822对红花扩增的灵敏度检测图（泳道Μ是天根化2000DNA ladder,泳道1为水的空白对照，泳道2-7分别为lOOng，lOng，Ing，0.Ing，0. 05ng，和 0.0Ing红花基因组DNA)
[0026] 图5利用特异性引物组合检测不同样品的PCR扩增结果（泳道Μ是天根化2000 DNA ladder,泳道1为空白对照，泳道2为阳性对照，泳道3-8分别为向日葵花瓣，红花花瓣， 油菜饼巧，含有红花成分的饼巧，油菜花粉，红花花粉）
【具体实施方式】
[0027] 为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术 方案。
[0028] -种红花物种特异性检测基因，其特征在于所述基因序列为下述的基因序列：
[0029]ttgcgtagatggaggcgtgatcttattccaccacagtggttaccggcaagagttagatat 60
[0030]ggtg曰曰gttg曰cgttg曰曰曰曰gg曰曰曰ggttg曰tggc曰曰g曰gc曰tttgctgc 曰gtgg曰tcgt 120
[0031]atgataggtcgtgttcgtaatgagaaggatgtgttagagcgtgtcgttgag 171
[0032] 红花DM条形码标准检测基因的PCR引物序列为：
[0033]沈QIDNO. 2HHF1651:ttgcgtagatggaggcgtgat 21
[0034]沈QIDNO. 3HHR1822:ctcaacgacacgctctaacac 21。
[0035] 一种红花物种的分子鉴定方法，包括：
[003引 1)从待测组织中分别提取DNA;
[0037] 2)W该DNA为模板用引物HHF1651和HHR1822通过PCR扩增出该基因；
[0038] 3)然后取适量步骤2)的PCR扩增出的基因用琼脂糖电泳分离，经漠化乙锭染色后 置于凝胶成像系统中观察，W无菌水为PCR空白对照，W红花基因组DNA为PCR阳性对照；
[0039] 4)当空白对照扩增无任何带型，阳性对照有与理论相符的清晰、单一条带则说明 PCR结果可靠。
[0040]PCR反应条件为：94°C预变性 2min;94°C变性 15s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个循环；72°C延伸lOmin。
[0041]PCR反应体系为：20ng/yLDM模板 1yL，10XPCR缓冲液巧OOmMKCiaOOmM Tris-HCl(抑 8. 3)，15mMMgCl2)2. 5yL，25mMMgCl22. 0yL，10mMdNTP0. 5μL，10μM引物 HHF1651和引物HHR1822各0. 25μL，DNA聚合酶0.抓，d地20补足至25μL。
[0042] 在GenBank中检索红花的基因序列，分析基因信息，优先选择具有完整序列和信 息的基因组序列和cDNA序列。然后将选择的序列进行Blastn分析，选择特异性强、相似 序列少的红花基因序列。W特异性强的基因序列为检测祀标，设计引物，进行PCR扩增分 析。最终筛选出来的引物组合具有W下特征：1、扩增条带清晰、单一；2、在所有的红花品种 中均有相同的扩增条带；3、在其他红花近缘种、常见的作物中均没有扩增。如图1所示是基 于本方法设计的引物组合HHF1651/HHR1822在红花CT0S-1基因（AB047859)序列中的位置 图。
[004引 实施例一
[0044] 利用HHF1651/HHR1822引物组合，其中
[0045]HHF1651 如序列表中沈QIDNO. 2 ;
[0046]HHR1822 如序列表中沈QIDNO. 3 ;
[0047] 进行PCR扩增鉴定。
[004引 1.实验材料
[0049] 1. 1植物材料
[0050] 进行试验的不同红花品种如表1所示。
[0051] 表1红花品种名称与产地
[0052]
[0053] 其他17种不同种属的材料分别有：向日葵Gfelianthusannuus)，大豆（Glycine max)，玉米狂eamays)，棉花（Gossypiumhirsutum)，番茄（Solanumlycopersicum)，小 麦（Triticum)，大麦(Hordeumvulgare)，虹丑（Vignaunguiculata)，古月萝h(Daucus carota)，油菜度rassicanapus)，辣椒（Capsicumannuum)，花生（Arachishypogaea)，芝 麻（Sesamumindi州m)，萝h(Raphanussativus)，水稻（Oryzasativa)，烟草（Nicotiana tabacum)，拟南芥（Arabidopsisthaliana)。
[0054] 1. 2酶与试剂
[00巧]分子生物学试剂，TAKARATaqDM聚合酶，10XPCR缓冲液，dNTPMixture(lOmM)，MgClz购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0056] 1. 3实验仪器
[0057]PCR扩增仪：DNAlingineDyadPeltierThermal切cler(Bio-Rad,USA);
[0058] 核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器