温度胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学中实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性的技术领域，尤 其涉及一种不同温度胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用。
【背景技术】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis属于鳞翅目螟蛾科，是我国水稻上重要害虫，为害水 稻形成枯鞘、枯心、白穗、枯孕穗和虫伤株等症状，造成巨大经济损失。随着水稻耕作制度的 更新和水稻品种的改变，二化螟的种群数量逐年增加。
[0003] 冬天低温条件下，二化螟在稻粧、稻草和其它田间禾本科等作物残体内顺利越冬， 5月上旬开始陆续羽化，其危害贯穿于水稻的整个生长季。在二化螟整个发生期，随着季节 变化，温度变化明显，而大量二化螟能够顺利的存活下来并繁衍后代，说明其对极端温度有 着超强的适应能力。因此，研究二化螟在不同温度条件下的耐受性及其作用机理对于二化 螟在农业生产上发生的预测预报及其综合防控具有重要意义。
[0004] 研究二化螟不同温度胁迫后体内相关基因的功能，其中最基本的技术方法就是对 功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的印记杂交，半定量RT-PCR等定 量分析方法比较，实时荧光定量PCR具有操作简单、特异性强、灵敏度高、线性关系好、成本 低等优点，是近年来最受科研工作者青睐的基因表达定量的方法。实时荧光定量PCR是一 种在PCR扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。它是在PCR扩 增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测和检测。一般通过内参法即利用内参基 因对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板 的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，Ct变异小是内参基因的必须满足的首要条 件，所以合适内参基因的选择成为定量的依据。因此，实时荧光定量PCR检测的准确性很大 程度上取决于内参基因的选择。理想的内参基因在各个外界因素的胁迫下，在各组织和细 胞中的表达是恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正样品 量以及实验过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可 以用于校正样品量之间的误差，这样获得的实验结果才更为可信。昆虫中常用的内参基因 有Rps3,Actin,GAPDH,Tublin,RpllO, 18SrRNA, 28SrRNA等，但实际上没有任何一个内参 基因mRNA表达水平在所有外在或内在的条件下都是恒定的，理想的内参基因是不存在的。 所以，一般要选择一个在处理因素作用的条件下表达相对稳定的基因作内参基因或内参标 准，这是实时荧光定量PCR成功与否的关键所在。
[0005] 因此，有必要进行二化螟与对温度胁迫后，进行一些功能基因的研究，期望可以获 得一些内参基因，从而为采用实时荧光定量PCR研究二化螟体内其他功能基因提供帮助。
【发明内容】
[0006] 昆虫体内的热激蛋白基因是与温度胁迫相关的重要基因。在本发明小组的前期 工作中，我们通过转录组测序技术获得了热激蛋白基因hsp20,hsp23. 7,hsp40,hsp70及 hsp90,但这些基因在二化螟体内对温度胁迫的反应尚未见报道，也无研究关于温度胁迫下 二化螟体内稳定的内参基因的相关报道。
[0007] 本发明提供一种温度胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用，为二化螟在不同 温度胁迫下进行实时荧光定量PCR反应时合适内参基因的选择提供依据。
[0008] -方面，TUB基因用作不同温度胁迫下二化螟实时荧光定量PCR中的内参基因的 用途。
[0009] 优选的，TUB基因作为考察温度胁迫下二化螟体内与适应温度调节相关的基因表 达量的内参基因的用途。
[0010] 优选的，考察二化螟体内与适应温度调节相关的基因表达量的方法为实时荧光定 量PCR〇
[0011] 优选的，本发明提供TUB基因作为内参基因在采用实时荧光定量PCR进行检测温 度胁迫下二化螟体内与适应温度调节相关的基因表达量上的用途。
[0012] 优选的，TUB基因为SEQIDNO: 1所示的片段。
[0013] 优选的，与适应温度调节相关的基因包括热激蛋白基因。
[0014] 优选的，所述的热激蛋白基因包括hsp70。
[0015] 优选的，hsp70基因为SEQIDNO: 12所示的片段。
[0016] 优选的，hsp70基因的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反： AGTCGACAAGCACAAATACT〇
[0017] 另一方面，本发明提供一种方法，采用该方法可以筛选出合适的内参基因，该内参 基因可以作为温度胁迫下二化螟体内相关功能基因表达量的研究。
[0018] 优选的，该功能目的基因为hsp70基因。该方法包括：提供备选的内参基因；以 未处理的二化螟为对照，采用四个低温和三个高温对二化螟3龄幼虫进行胁迫处理，处理 后收集二化螟样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以各样 品cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行验证，采用ΛCt，RefFinder， BestKeeper，GeNorm，NormFinder软件进行数据分析，从而筛选出二化螟3龄幼虫体内在温 度胁迫条件下最稳定表达的内参基因。
[0019] 优选的，所述备选的内参基因为微管蛋白（Beta-tubulin，TUB)，延伸因 子-1a(Elongationfactor-1α，EF1)，E2F车专录因子 4 (E2Ftranscriptionfactor4， TF4)，3_ 憐酸甘油酸脱氛酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)，精氛 酸激酶（ArgininaseKinase，AK)，核糖体蛋白S2(RibosomalproteinS2，RPS2)，核糖体 蛋白S3(RibosomalproteinS3，RPS3)，核糖体蛋白S5(RibosomalproteinS5，RPS5)， 核糖体蛋白L10(RibosomalproteinL10，RPL10)，β-肌动蛋白Beta-Actin(ACTB)， 肌动蛋白Al(ActinA1，ACTA1)。优选的，所述的进行实时荧光定量PCR方法对备选 的 11 个基因所对应的引物为：Beta-tubulin(TUB):正：CTCCGACTTACAGTTAGAGC，反： AGTACTGAATCGACAAGCTC;Elongationfactor-1a(EF1):正：CTGGGTATTGGACAAACTGA，反： GAGGTTCCTGTGATCATGTT;E2Ftranscriptionfactor4 (TF4):正：TTTGATTACTAACGGGTGCA， 反：TTCTTCAACTTCAAGCGAGA;Glyceraldehyde_3-phosphatedehydrogenase(GAPDH): 正：GGGTATTCTTGACTACAC，反：CTGGATGTACTTGATGAG;ArgininaseKinase(AK):正： CTGAAGAAGTACCTTACC，反：CAATCCAGCAGAGTTGAG;RibosomalproteinS2 (RPS2):正： CATACCCAGCGAGTTGATTA，反：CAAAAGAGCAGCAAGACAAA;RibosomalproteinS3 (RPS3):正：CGGAGATCATCATTATGG，反：GAGTTTGTATCTGAGAGAC;RibosomalproteinS5 (RPS5): 正：GAGTAGGAAGAGGAGGTTCT，反：TTGGCTGAACTCCTAATTCC;Ribosomalprotein LIO(RPLIO):正：GACTTGGGTAAGAAGAAG，反：GATGACATGGAATGGATG;Beta_Actin(ACTB): E:GATCATGTTTGAGACCTT;i:GATCTTCATGAGGTAGTC;ActinAl(ACTAl):E: GTATTGTCCGGTGGTACTAC，反：GGAGCGATGATCTTGATCTT。
[0020] 优选的，hsp70基因的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反： AGTCGACAAGCACAAATACT〇
[0021] 优选的，不同温度对二化螟3龄幼虫进行胁迫处理的方法为：分别选取低温5°C， 10 °C，15 °C，20 °C，高温30 °C，35 °C，40 °C胁迫3小时以及常温25 °C条件下处理的二化螟3龄 幼虫为实验材料，提取总RNA，测RNA浓度，反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；
[0022] 优选的，二化螟cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度。
[0023] 优选的，二化螟的饲养条件：从稻田采集的二化螟幼虫，在人工气候室：温度 25°C，湿度75%，光照：黑暗=14小时：10小时的条件下，用人工饲料饲养2代后，利用3龄 幼虫进行温度胁迫处理；
[0024]优选的，温度胁迫方法：设置光照培养箱（15°C，20°C，25°C，30°C，35°C，40°C)或 冰箱（5°C，10°C)到处理温度，将二化螟3龄幼虫放置在含有人工饲料的玻璃管中，用棉塞 封口，处理3小时后，收集样品提取总RNA;每个处理设置3个生物学重复。
[0025] 优选的，实时荧光定量PCR的体系和条件分别为：实时荧光定量PCR的反应