用于产生用于定向进化的文库的方法
【专利说明】用于产生用于定向进化的文库的方法
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求于2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769, 517的优先权利益，所 述美国临时申请在此通过引用并入。
[0002] 发明背景 一般而言，本发明涉及改进的核酸文库产生。
[0003] 多样化遗传序列的文库可以用于鉴定具有特定功能的蛋白。例如，商业上有价值 的功能序列可以通过下述进行鉴定：表达多样化遗传序列的文库，就特定功能测试所得的 蛋白，并且分离良好表现的那些序列。该过程可以被称为定向进化。通过多样化和选择的 反复循环，序列可以进一步就特定功能进行最佳化。选自多样化序列库的序列可以用于生 物学、医学或工业应用中。例如，通过定向进化鉴定的序列可以用于抗体工程改造中。
[0004] 生成多样化遗传序列的文库的现有方法通常是无效的。例如，现有方法可以包括 无效的连接步骤或需要昂贵的引物组。对已知方法的速度和成本效益的改进将增加文库生 成的效率，允许多重功能序列的高流通量平行处理，并且促进新功能序列的鉴定。
[0005] 发明概述 本发明包括生成目的序列的变体文库的方法。该方法可以包括下述步骤：首先提供包 括目的序列的模板DNA分子，并且提供一对寡核苷酸，其中寡核苷酸之一可以是受保护的， 并且另一寡核苷酸可以是未受保护的，并且其中寡核苷酸与目的序列的相反链杂交且侧接 目的序列。后续步骤可以包括使用寡核苷酸对模板DNA分子进行扩增反应，从而生成dsDNA 变体群体，随后为使dsDNA变体群体与酶一起孵育的步骤，所述酶能够相对于dsDNA变体的 受保护链选择性降解未受保护的链，从而产生ssDNA变体群体。接下来，ssDNA变体群体可 以与ssDNA中间体（intermediaries)杂交，其可以包括与目的序列或其片段基本上相同的 序列，生成异源双链DNA。在异源双链DNA生成后，后续步骤可以包括将异源双链DNA转化 到细胞内，从而生成目的序列的变体文库。
[0006] 模板DNA分子可以是线性dsDNA分子、环状dsDNA分子、环状ssDNA分子、尿啼啶 化的（uracilated)环状ssDNA分子或甲基化的环状ssDNA分子。模板DNA分子的序列可 以与ssDNA中间体的序列基本上相同。
[0007] 目的序列可以大于100个碱基对，大于300、大于500或大于700个碱基对。目的 序列可以是100 - 2000个碱基对、300 - 1500个碱基对或700 - 1200个碱基对。
[0008] 在一些实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括三个或更多个5'硫代硫酸酯 的寡核苷酸。受保护的寡核苷酸可以包括三、四或五个5'硫代硫酸酯。未受保护的寡核苷 酸可以是不包括三个或更多个5'硫代硫酸酯的寡核苷酸。在一些实施方案中，能够相对于 受保护的链选择性降解未受保护的链的酶可以是T7核酸外切酶或λ核酸外切酶。在其他 实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括5'磷酸酯的寡核苷酸，并且未受保护的寡核苷 酸可以是不包括5'磷酸酯的寡核苷酸。在此类实施方案中，能够相对于受保护的链选择性 降解未受保护的链的酶可以是λ核酸外切酶。
[0009] 在多个实施方案中，扩增反应可以是PCR反应、易错PCR反应、等温扩增反应或滚 环扩增反应。在一些实施方案中，dsDNA变体群体的50%dsDNA变体与目的序列具有小于 99. 5%同一性，或与目的序列具有小于98%同一性。
[0010] 上述实施方案中的任一个均可进一步包括在与能够相对于受保护的链选择性降 解未受保护的链的酶一起孵育前，纯化dsDNA变体群体。上述实施方案中的任一个均可进 一步包括在与ssDNA中间体杂交前，纯化ssDNA变体群体。
[0011] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA中间体可以包括与目的序列或其片段具有至 少50%、至少70%、至少90%或100%同一性的序列。ssDNA中间体可以是包括与噬菌粒序列 基本上相同的序列片段的噬菌粒或载体。
[0012] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA变体群体与ssDNA中间体的杂交可以包括 ssDNA变体群体和ssDNA中间体在变性温度下的共孵育，随后逐步冷却至退火温度。变性温 度可以是约90°C。退火温度可以是约55°C。逐步冷却以约-1°C/分钟的速率发生。
[0013] 本发明的细胞可以是真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。
[0014] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA中间体可以包括经修饰的核碱基，或除腺嘌 呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基。细胞能够选择性降解ssDNA中间体。在一些 特定实施方案中，ssDNA中间体可以是尿嘧啶化的ssDNA中间体。在其他特定实施方案中， ssDNA中间体可以是甲基化的ssDNA中间体。在某些实施方案中，能够选择性降解ssDNA中 间体的细胞可以是Ung+细菌细胞或TG1大肠杆菌（AcWi)细胞。在其他实施方案中，能 够选择性降解ssDNA中间体的细胞可以是Mcr+细菌细胞。
[0015] 进一步的实施方案可以包括通过使异源双链DNA与DNA聚合酶的孵育，延伸与 ssDNA中间体杂交的ssDNA变体。异源双链DNA与DNA聚合酶的孵育可以包括异源双链DNA 与DNA聚合酶和DNA连接酶的孵育。ssDNA中间体可以是甲基化的ssDNA中间体，并且该方 法可以进一步包括使异源双链DNA变性，且使变性产物与选择性降解甲基化的DNA的酶一 起孵育的步骤。在特定实施方案中，甲基化的ssDNA中间体可以包括甲基化的腺嘌呤核碱 基，并且选择性降解甲基化的DNA的酶可以是Dpnl。在一些实施方案中，ssDNA变体可以是 甲基化的，并且ssDNA中间体可以是非甲基化的，并且该方法进一步包括使异源双链DNA变 性，且使变性产物与选择性降解非甲基化的DNA的酶一起孵育的步骤。在特定实施方案中， 甲基化的ssDNA变体包括甲基化的胞嘧啶或鸟嘌呤核碱基，并且使得选择性降解非甲基化 的DNA的酶可以是Sau3AI或识别DNA序列5' -GATC-3'的限制性酶。
[0016] 在上述实施方案的任一个中，该方法可以进一步包括在转化到细胞内之前，纯化 异源双链DNA。异源双链DNA转化到细胞内可以包括两个或更多个、10个或更多个、20个或 更多个、或者50个或更多个细胞等分试样的独立转化。变体文库的一个或多个等分试样可 以进行培养，以生成培养的文库。等分试样可以在回收培养基中进行培养。变体文库的一 个或多个等分试样可以独立地进行培养，或在单一培养物中组合。培养的文库可以沉淀，以 生成沉淀的培养的文库。沉淀的培养的文库可以贮存于_20°C或更低的温度下。沉淀的培 养的文库可以重悬浮，以生成重悬浮的沉淀的培养的文库。重悬浮的沉淀的培养的文库可 以贮存于_20°C或更低的温度下。培养的文库的一个或多个等分试样可以与辅助噬菌体一 起孵育，生成噬菌体展示文库。培养的文库的一个或多个等分试样可以独立地与辅助噬菌 体一起孵育，或可以组合用于与辅助噬菌体一起孵育。噬菌体展示文库可以沉淀，以生成沉 淀的噬菌体展示文库。沉淀的噬菌体展示文库可以贮存于_20°C或更低的温度下。沉淀的 噬菌体展示文库可以重悬浮，以生成重悬浮的沉淀的噬菌体展示文库。重悬浮的沉淀的噬 菌体展示文库可以贮存于-20°C或更低的温度下。培养的文库可以进行稀释或系列稀释， 以生成稀释或系列稀释的培养的文库。稀释或系列稀释的培养的文库可以铺平板至培养平 板，使得培养平板可以在有助于细胞生长或分裂的温度下进行孵育。
[0017] 在上述实施方案的任一个中，目的序列可以编码抗体或其结构域或片段、聚合酶 或其结构域或片段、酶或其结构域或片段、单链可变片段抗体或其结构域或片段、激酶或其 结构域或片段、DNA结合蛋白或其结构域或片段、RNA结合蛋白或其结构域或片段、转录因 子或其结构域或片段、或者人蛋白或其结构域或片段。目的序列或ssDNA中间体的序列可 以包括细菌噬菌体外壳蛋白。
[0018] 在一些实施方案中，至少30%、至少50%或至少70%的经转化的细胞可以包括目的 序列的变体。
[0019] 在上述实施方案的任一个中，可以由两种或更多种不同目的序列各自开始，平行 进行提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使用寡核苷酸对模板DNA分子 进行扩增反应，并且使所得的dsDNA变体群体与能够相对于dsDNA变体的受保护链选择性 降解未受保护的链的酶一起孵育的步骤，以产生两种或更多种ssDNA变体的群体，使得寡 核苷酸、扩增反应和酶可以在将步骤中的任一个或全部的应用于两种或更多种不同目的序 列各自中不同。ssDNA变体群体可以在与ssDNA中间体的后续杂交之前或期间混合。在一 些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的至少两种可以由单一模板DNA分子扩增。 在某些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的全部可以由单一模板DNA分子扩增。 在一些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的至少两种可以由不同模板DNA分子扩 增。在某些实施方案中，两种或更多种不同目的序列各自可以由不同模板DNA分子扩增。在 另外其他实施方案中，对于两种或更多种不同目的序列中的至少两种，平行进行的一个或 多个步骤可以在单一反应中进行。在一些实施方案中，对于两种或更多种不同目的序列中 的全部，平行进行的一个或多个步骤可以在单一反应中进行。在一些实施方案中，对于两种 或更多种不同目的序列中的至少两种，或者对于两种或更多种不同目的序列各自，平行进 行的一个或多个步骤可以分开进行。在特定实施方案中，ssDNA中间体可以包括与两种或更 多种不同目的序列各自或其片段基本上相同的序列，使得杂交涵盖两个或更多个ssDNA变 体群体各自与ssDNA中间体的杂交。在某些实施方案中，两个或更多个ssDNA变体群体可 以同时或相继地与ssDNA中间体杂交。
[0020] 通过易错PCR生成dsDNA变体群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列 的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷 酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代 硫酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，并且使用寡核苷酸对模板DNA分子进行易错PCR，从 而生成dsDNA变体群体。
[0021 ] 通过易错PCR生成ssDNA变体群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列 的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷 酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代 硫酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，使用寡核苷酸对模板DNA分子进行易错PCR，从而生 成dsDNA变体群体，并且使dsDNA变体群体与能够水解dsDNA变体的非硫代磷酸酯链、但非 硫代磷酸酯链的酶一起孵育，从而产生ssDNA变体群体。
[0022] 通过PCR生成dsDNA分子群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的 模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸 之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代硫 酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，并且使用寡核苷酸对模板DNA分子进行PCR，从而生成 dsDNA分子群体。
[0023] 通过PCR生成ssDNA分子群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的模 板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸之 一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代硫酸 酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，使用寡核苷酸对模板DNA分子进行PCR，从而生成dsDNA分 子群体，并且使dsDNA分子群体与能够水解dsDNA分子的非硫代磷酸酯链、但非硫代磷酸酯 链的酶一起孵育，从而产生ssDNA分子群体。
[0024] 噬菌体展示方法可以包括下述步骤：提供通过本发明的实施方案生成的变体文 库，培养变体文库的一个或多个等分试样，以生成培养的变体文库，使培养的变体文库的一 个或多个等分试样与辅助噬菌体一起孵育，以生成噬菌体展示文库，使得噬菌体展示文库 的细胞展示由目的序列编码的蛋白变体，使噬菌体展示文库的细胞与靶分子接触，使得由 目的序列编码的蛋白变体中的一种或多种可以与靶分子相互作用，并且从噬菌体展示文库 的细胞中分离展示与靶分子相互作用的变体蛋白的那些细胞。变体蛋白可以通过下述与 靶分子相互作用：结合靶分子，切割靶分子，催化靶分子的反应，诱导靶分子中的构象变化， 或修饰靶分子。靶分子可以是小分子、蛋白或其结构域或片段、病原体蛋白或其结构域或片 段、酶或其结构域或片段、或者人蛋白或其结构域或片段。
[0025] 选择性降解非重组核酸的方法可以包括下述步骤：提供包括具有限制性位点的至 少一个区段的第一核酸；提供包括不含限制性位点的至少一个区段的第二核酸；对第一核 酸和第二核酸实施用于重组第一核酸和第二核酸的反应，使得第一核酸的区段替换为第二 核酸的区段，从而生成不包括限制性位点的重组产物；将反应产物转化到表达能够切割限 制性位点的限制性酶的细胞内；并且以足以允许由细胞表达的限制性酶切割的方式孵育细 胞。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括不含由限制性酶切割的限制性位点的重组产 物的步骤，和/或从细胞中分离重组产物的步骤。限制性酶可以是Ec〇29kI。在这些方法的 任一种中，重组产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链，由第一核酸的至少 一部分和第二核酸的至少一部分编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一种 或多种。
[0026] 选择性降解非诱变核酸的方法可以包括下述步骤：提供包括具有限制性位点的至 少一个区段的第一核酸；提供具有至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含限制 性位点，且能够与具有限制性位点的第一核酸的至少一个区段杂交；使第二核酸与第一核 酸杂交，生成异源双链DNA;分辨异源双链DNA，从而生成不包括限制性位点的产物；将反 应产物转化到表达能够切割限制性位点的限制性酶的细胞内；并且以足以允许由细胞表达 的限制性酶切割的方式孵育细胞。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括不含由限制 性酶切割的限制性位点的产物的步骤，和/或从细胞中分离产物的步骤。限制性酶可以是 Ec〇29kI。在这些方法的任一种中，产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链， 由第二核酸的至少一部分或其序列编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一 种或多种。在这些方法的任一种中，第一核酸可以是ssDNA中间体，并且第二核酸可以是 ssDNA变体。
[0027] 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法可以包括下述步骤：提供在以其他方式 能够表达的开放读码框的至少一个区段中包括一个或多个终止密码子的第一核酸；提供包 括不含终止密码子的至少一个区段的第二核酸；对第一核酸和第二核酸实施用于重组第一 核酸和第二核酸的反应，使得第一核酸的区段替换为第二核酸的区段，从而生成在开放读 码框中不包括终止密码子的重组产物；将反应的产物转化到细胞内；并且使细胞孵育足以 允许开放读码框表达的时间段。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括由开放读码框表 达的蛋白或其部分的步骤，所述开放读码框包括第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至 少一部分的序列，和/或从细胞中分离由开放读码框表达的蛋白或其片段的步骤，所述开 放读码框包括第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至少一部分的序列。在这些方法的任 一种中，重组产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链，由第一核酸的至少一 部分和第二核酸的至少一部分编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一种或 多种。在这些方法的任一种中，重组反应可以是诱变反应，其中第一核酸是ssDNA中间体， 并且第二核酸是ssDNA变体。
[0028] 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法可以包括下述步骤：提供在以其他方式 能够表达的开放读码框的至少一个区段中包括一个或多个终止密码子的第一核酸；提供包 括至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含终止密码子，且能够与具有一个或多 个终止密码子的第一核酸的至少一个区段杂交；使第二核酸与第一核酸杂交，生成异源双 链DNA;分辨异源双链DNA，从而生成在开放读码框中不包括终止密码子的产物，将反应的 产物转化到细胞内；并且使细胞孵育足以允许开放读码框表达的时间段。该方法可以进一 步包括测定细胞是否包括由开放读码框表达的蛋白或其部分的步骤，所述开放读码框包括 第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至少一部分的序列，和/或从细胞中分离由开放读 码框表达的蛋白或其片段