棉花内生细菌hb3s-13及其在棉花黄萎病防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病理学，具体地说，本发明设及棉花内生细菌皿3S-13及其在棉 花黄萎病防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病（Verticilliumwiltofcotton)是棉花上的一种重要病害，棉花黄 萎病是由大丽轮枝菌（Verticilliumd址IiaeKIeb.)引起的±传真菌病害，它能导致棉 花严重减产甚至植株死亡。棉花黄萎病的常规防治方法有培育抗病品种、农业措施和化学 防治等。由于大丽轮枝菌的变异性，使得抗病品种的培育和推广受到制约。水旱轮作被证明 是一种较为有效的方法，但其对棉田结构和水源的要求较高。化学防治方法会造成对环境 的污染，而且运种方法不仅杀死了病原菌，也杀死了 ±壤中的有益微生物，后者无论对自然 还是农业±壤系统的维持都有重要的作用。鉴于此，人们致力于寻找有效的替代方法。生 物防治是一种有应用前景的方法，利用生物防治对棉花黄萎病进行防治，能在改善作物生 长和产量的同时确保自然环境的安全，具有可持续发展的战略意义。
[0003] 利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。关于用内 生菌作为生防菌来防治棉花黄萎病的研究，国内的报道也并不鲜见，但是目前实现规模化 生产并能够用于生产实践的却并不多，其中枯草芽抱杆菌算是一个较为成功的例子，其生 物防治的作用机理主要是是产生杆菌肤等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具 有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是大田防治效果较低， 国内登记的枯草芽抱杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在45%左右，且在不同年份效果不 稳定。因此，有必要发掘出对棉花黄萎病的防治更加有效的菌种资源，为将来生物源农药的 开发提供相应的基础。
[0004] 内生细菌作为生防菌的优势在于细菌为单细胞，生长繁殖快，便于大规模的发酵 生产和保存。细菌防治植物病害的机制主要有抗生作用，营养和位点的竞争作用，重寄生作 用W及诱导植物抗性作用。
【发明内容】
阳〇化]发明目的：本发明的发明人针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一 种棉花内生细菌皿3S-13,W实现用其对棉花黄萎病进行生物防治。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述所述棉花内生细菌皿3S-13在棉花黄萎病防治 中的应用。
[0007] 技术方案：为了实现本发明上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种棉花 内生细菌，其分类命名为：(Agrobacteriumsp.)皿3S-13,已保藏于中国典型培养物保藏 中屯、（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCCN0:M2015604,保藏日期： 2015年10月13日。 阳00引所述棉花内生细菌皿3S-13,是从健康棉株茎部和根部分离筛选获得的对棉花黄 萎病具有较好生防效果、且防效效果稳定的内生细菌，该内生细菌能在棉花体内很好的定 殖，对人畜、昆虫、植物安全无毒，还具有如下性质：
[0009] 1、形态特征
[0010] 菌株皿3S-13在NA培养基上的菌落形态为淡黄色，菌落为圆形，有凸起；对菌株 皿3S-13进行革兰氏染色，判断皿3S-13为革兰氏阴性杆状细菌。
[0011] 2、16SrRNA分析
[0012] 用16SrRNAITS序列的相应引物扩增，扩增产物进行纯化和测序，测序结果与 NCBI上的序列进行比对后发现，皿3S-13内生细菌与根瘤菌属的16SrRNAITS序列的同源 性达到100%，因此，将皿3S-13归属为根瘤菌属（Agrobacteriumsp.)。
[0013] 为了实现本发明的另一目的，本发明提供了上述所述棉花内生细菌皿3S-13在棉 花黄萎病防治中的应用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 1、皿3S-13能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于生物防治的菌株必须 能够在人工培养基上培养，W利于工厂化生产和推广应用。
[0016] 2、本发明的棉花内生细菌皿3S-13对棉花黄萎病具有较好防效的细菌，其防治效 果为64. 87~75. 21 %，且防效稳定，对作物生长无毒负作用，对人畜、昆虫和作物安全，环 境友好，与生产上应用较多的枯草芽抱杆菌（防效为46. 0%~52. 9% )相比，防治效果提 高50%左右；另外，本发明的棉花内生细菌皿3S-13经鉴定此细菌为革兰氏阴性杆状细菌， 为根瘤菌属（AgrobacteriumSP.)，尚没有该菌在棉花黄萎病上的生防效果报道，具有较大 的潜力开发成为商业的生防制剂。
【附图说明】
[0017] 图1为皿3S-13在NA培养基上的形态；
[0018] 图2曰、图2b分别为革兰氏染色皿3S-13后的形态图；
[0019] 图3为皿3S-13的16SrRNA序列在NCBI上的比对结果图；
[0020] 图4为皿3S-13对大丽轮枝菌的括抗作用结果图；
[0021] 图5为大丽轮枝菌抱子液与皿3S-13细菌菌液等体积混合后得到的混合液1对棉 苗接种后30d的防治效果图；
[0022] 图6为大丽轮枝菌抱子液与皿3S-13细菌发酵液等体积混合后得到的混合液2对 棉苗接种后30d的防治效果图；
[0023] 图7为仅接种大丽轮枝菌抱子液后30d的棉苗生长对照图（阳性对照组图）；
[0024] 图8为皿3S-13细菌与大丽轮枝菌对扣培养的对照生长速度比较图，其中（a)为 与皿3S-13细菌对扣培养14d后大丽轮枝菌的菌落生长情况，化）为与空白皿对扣培养14d 后大丽轮枝菌的菌落生长情况。 阳0巧]内生细菌皿3S-13,于2015年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中屯、 (CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCN0:M2015604。
【具体实施方式】
[00%] W下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明 的保护范围并不限于运些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。
[0027] W下实施例所使用的培养基配方为：
[0028] 查氏培养基配方：硝酸钟2g，憐酸氨二钟Ig,硫酸儀0.5g，氯化钟0.5g，硫酸亚铁 0.Olg,薦糖 30g，琼脂 15g，蒸馈水 1L，pH7. 3 + 0. 2 ;
[0029]PDA平板培养基配方：马铃馨200g，薦糖20g，琼脂20g，蒸馈水IL;
[0030] NA培养基配方：牛肉膏3g，蛋白腺lOg，氯化钢5g，琼脂20g，pH7. 3， 阳0川 蒸馈水1L。 阳0巧实施例1
[0033] 棉花内生菌皿3S-13的分离方法。
[0034] 棉花内生菌的分离过程全部在超级工作台内进行，主要针对棉花的茎杆和主根进 行分离。将棉花的茎杆和主根切成3cm长的植物片段样品，然后将切成的植物样品按照W 下程序进行表面消毒：利用70% (v/v)的酒精消毒Imin,然后用5% (v/v)的次氯酸钢消 毒5min，再次用70% (v/v)的酒精消毒30s，最后用无菌水漂洗3~5次，每次3min。消毒 完成的植物样品放在无菌的干燥滤纸上，无菌条件下吸干表面的水分。用消毒的手术刀将 茎杆和根的样品两端浸入消毒剂，其余部分用消毒手术刀切片，每片大约2mm厚。切好的样 品薄片立刻