一种分子量内标及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种新型分子量内标及其应用。尤其是设及 一种能清晰地分辨单个碱基、确保正确分型的分子量内标及其应用
【背景技术】
[0002] 基因组扫描（genomescanning)是从全基因组的遗传标记中寻找与特定性状或基 因紧密连锁的标记，并在染色体上定位相关基因的方法。而基因分型（Genotyping)又称为 基因型分析（Genotypicassay),是利用生物学检测方法测定个体基因型（Genotype)的技 术，其中使用技术的包括聚合酶链反应（PCR)、DNA片段分析、寡核巧酸探针（AS0probes)、 基因测序、核酸杂交、基因忍片技术等。人类基因组计划开始W来，基因扫描和基因分型技 术发展迅速。在致病基因筛查，疾病基因连锁和关联分型，肿瘤等疾病早期诊断、法医学个 体识别等方面都广泛应用。基因分型技术重要的手段就是利用DNA测序仪或遗传分析仪分 析基因片段的分子量。运类仪器分析分子量时需要一个分子量标准来对样品进行计算，也 就是分子量内标，又称为分子量内对照（InternalLaneStandard)。
[0003]目前常用的分子量内标，如LIZ-500,其由15条带有LIZ巧光素（红色）标记的 双链DNA片段组成，分子量分别是：3化P、50bp、7化P、IOObp、139bp、150bp、160bp、200bp、 250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp和 500bp，运些DNA片段之间的分子量差都 大于或等于lObp，是通过先对质粒酶切，再连接上一条带巧光素的寡核巧酸得到的内标片 段。而在STR分型的过程中，由于遗传分析仪上Buffer槽中的Buffer、水槽中的水、毛细管 W及POP胶和甲酯胺均会出现过期或不合格现象。而且也会出现很多的扩增片段，当扩增 的片段比较大且大小相近，而标记引物颜色相同时，使用现有的DNASTR检测用标准物质即 分子量内标检测DNA时就不能保证单个碱基分辨率，也就不能在Buffer槽中的Buffer、水 槽中的水、毛细管W及POP胶和甲酯胺中某一部分出现过期或不合格时保证基因分型的正 确。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有分子量内标在使用时存在的不足，提供一种能清晰地分辨单个碱 基，确保正确分型，从而方便操作人员判读的分子量内标及其应用。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案
[0006] 一种分子量内标，由n条不同分子量的带有可识别的标记物的核巧酸片段构成； 其中至少包含P对相差一个碱基的核巧酸片段对；所述相差一个碱基的核巧酸片段对中一 个片段的碱基数为m，另一个片段的碱基数为m+1或m-1。
[0007] 其中，在一些实施方案中，所述n为偶数时，P为1~n/2。即至少包含1~n/2对 相差一个碱基的核巧酸片段。如n为10时，P可W为！~10/2。即可W包含1对、2对、3 对、4对或5对相差一个碱基的核巧酸片段对。
[0008] 在一些实施方案中，所述n为奇数时，P为！~（n-1)/2。即至少包含1~（n-1)/2 对相差一个碱基的核巧酸片段。如n为11时，P可W为！~（11-1)/2。即可W包含I对、 2对、3对、4对或5对相差一个碱基的核巧酸片段对。
[0009] 在一些优选实施方案中，本发明所述分子量内标中P为2~6。即本发明所述分子 量内标中包含2~6对相差一个碱基的核巧酸片段对。
[0010] 在一些实施方案中，本发明分子量内标中所述的碱基数m在30~5000个之间。
[0011] 在一些实施方案中，所述的碱基数m在30~1000个之间。
[0012] 在一些优选实施方案中，所述的碱基数m在30~600个之间。
[0013] 在一些实施方案中，本发明分子量内标中所述可识别的标记物为巧光标记物，其 巧光发射区域在400皿至1000皿范围内。
[0014] 优选地，所述的巧光标记物包括但不局限于W下巧光素：LIZ、FAM、肥X、JOE、TMR、 TET、VIC、NH635、C巧。
[0015] 本发明还提供了所述的分子量内标在片段分析中的应用。
[0016] 优选地，所述片段分析包括但不局限于STR分型、测序、大片段分析W及基因组 分析。
[0017] 本发明还提供了一种包括本发明所述的分子量内标的片段分析试剂盒。
[0018] 本发明制备的分子量内标是带有巧光标记物的DNA分子。一般使用方法是加入去 离子甲酯胺，95'C加热3-5分钟变性，迅速置于冰上冷却3分钟。
[0019] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种分子量内标，由n条不同分子量的带有 可识别的标记物的核巧酸片段构成；其中至少包含P对相差一个碱基的核巧酸片段对；所 述相差一个碱基的核巧酸片段对中一个片段的碱基数为m，另一个片段的碱基数为m+1或 m-1。本发明所述分子量内标相对现有的商业分子量内标而言，具有分辨单个碱基的能力， 可W有效地区分相差一个碱基的PCR产物片段，能确保正确分型，从而方便检测人员判读， 广泛适用于STR分型，测序，大片段分析W及基因组分析。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0021] 图1示实施例2STR分型检测结果图，其中图a为Fam标记的产物片段；图b为化X 标记的产物片段；图C为Tamra标记的产物片段；图d为本发明内标片段；横坐标为碱基数 目，纵坐标为信号强度；
[002引图2示实施例2传统分子量内标与基因共同电泳检测分型结果图谱，其中图a为Fam标记的产物片段，A表示Fam标记的产物片段，并且在Bin上，背景暗色竖纹为Bin;B表 示为Fam标记的产物片段，并且不在Bin上；图b为传统内标片段；横坐标为碱基数目，纵坐 标为信号强度；
[0023] 图3示实施例2本发明分子量内标与基因共同电泳检测分型结果图谱，其中图a 为Fam标记的产物片段，A表示Fam标记的产物片段，并且在Bin上；B表示为Fam标记的产 物片段，并且不在Bin上；图b为本发明分子量内标片段；横坐标为碱基数目，纵坐标为信 号强度；
[0024] 图4示实施例2本发明分子量内标毛细管电泳图谱，其中横坐标为碱基数目，纵坐 标为信号强度；
[00巧]图5为图4的75bp和76bp的局部放大图，其中横坐标为碱基数目，纵坐标为信号 强度；
[0026] 图6为图4的500bp和5(Ubp的局部放大图，其中横坐标为碱基数目，纵坐标为信 号强度。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合本发明实施