一株耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌及其在降解石油中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株铜绿假单胞菌及其应用，尤其涉及一株耐受微氧和高盐环境的铜 绿假单胞菌Yal及其在降解石油中的应用或在降解被石油污染的土壤或水体中的石油的 应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着我国石油工业的发展，石油开采力度与需求总量逐年上升。然而石油在给人 们带来巨大经济利益的同时，也对周边生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以 及储存过程中，石油所造成的土壤污染问题是一个长期存在的环境问题。目前受石油污染 的土地面积在不断扩大，污染程度愈发严重，给油田以及周边的生态环境带来了严重的破 坏（2002年，Rahman等）。石油经类进入土壤后，会破坏土壤结构，分散土粒，使土壤的透 水性降低；其富含的反应基能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤 有效磷、氮的含量减少；特别是其中的多环芳烃，因有致癌、致变、致畸等活性和能通过食物 链在动植物体内逐级富集，从而更具危害（1985年，Bossert and Bartha;1980年，Liu)。 同时，土壤中的石油组分会污染地表水体，甚至随着时间推移而逐步渗漏并污染地下水，并 且，石油开采过程也会产生大量含油废水。引用被石油污染的水源进行农灌，会影响农作物 正常生长发育，降低农作物的抵抗力。而且随着农作物的生长，石油污染物会逐渐富集，最 终影响到人类的身体健康（2002年，Abed等）。因此治理石油所造成的土壤和水体污染具 有十分重要的现实意义，也是目前环境保护领域中的研究热点。
[0003] 目前石油污染的处理方法按其性质可分为三种，即物理方法，化学方法和生物方 法。相较而言，生物方法具有物理方法和化学方法无可比拟的优势：首先是处理费用低，其 处理成本大约只有物化方法的三分之一；其次是修复操作简单，可以原位进行修复；再次 生物法修复对环境的二次污染较小（2012年，Zhen-Yu W等）。但是，利用微生物降解石油 并修复石油污染的土壤与水体在实际应用中面临自然环境的挑战，主要表现为高盐和微氧 等不利因素限制了部分具备高效降解石油能力的微生物的生长和繁殖，从而极大地限制了 实际应用效果（2011年，Ld)k〇wska等）。目前，对于铜绿假单胞菌在高盐和微氧等条件下 降解石油能力的相关报道较少。从大庆油田采出液及原油污染物中分离出一株具备石油降 解能力的铜绿假单胞菌，2%盐度培养条件对该菌的生长具有一定的促进作用，降油率可以 达到17. 4%，但是该菌株在5%盐度及以上时仅能维持缓慢生长，降油率和降粘率大幅度 下降（2007年，郝东辉等），无法满足和适应工业实际应用或不同地域的大规模应用。
[0004] 参考文献：
[0005] 1. Rahman K S M, Thahira-Rahman J, Lakshmanaperumalsamy P, et al. J. Bioresource technology, 2002, 85(3):257-261.
[0006] 2. Bossert I, and Bartha R. J. Soil Science, 1985, 140 (1) : 75-77.
[0007] 3. Liu D. J. Bulletin of environmental contamination and toxicology, 1980, 25(1):616-622.
[0008] 4. Abed R Μ M, Safi NMD, Kostcr J, et al.J. Applied and Environmental Mi crobiology, 2002, 68(4):1674-1683.
[0009] 5. Zhen-Yu ff, Ying X U, Ha〇-Yun ff, et al. J. Pedosphere, 2012, 22(5) :717-725.
[0010] 6. Lcbkowska M, ZborowskaE, Karwowska E, et al. J. Ecological Engineeri ng, 2011, 37(11) :1895-1900.
[0011] 7.郝东辉，宋建蓉，王自豪，等.J.中国科技论文在线，2007, 1-8.
【发明内容】
[0012] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株耐受微氧和高盐环境的铜 绿假单胞菌Yal及其在降解石油中的应用或在降解被石油污染的土壤或水体中的石油的 应用。
[0013] 本发明的耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述菌株命名为铜 绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) Yal，该菌株已于2015年9月18日保藏于"中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，其保藏编号为CGMCC N0. 11426。
[0014] 上述耐受微氧和高盐环境的可降解石油的铜绿假单胞菌菌株，其生物学特征是： 细胞呈现短杆状（见图1)，单个，大小为（〇. 6 μ m~0. 8 μ m) X (1. 0 μ m~1. 3 μ m)，可运动； 菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润；菌落呈灰白色，周围培养基常有水溶 性色素扩散；可在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上培养时能够降解石油，同时产 生降解圈（见图2)。生理生化特征是：革兰氏染色阴性，微好氧，化能异养菌，发酵葡萄糖产 酸产气，过氧化氢酶试验、甲基红试验和明胶水解试验呈现阳性，抗酸染色试验、吲哚试验、 VP试验、淀粉水解试验呈现阴性。最适生长温度为28~37°C，最适合生长pH值为6. 5~ 7. 5。生理生化实验结果详见表1，与铜绿假单胞菌模式菌株相比完全一致。
[0015] 表1 :Yal菌株（CGMCC N0. 11426)与铜绿假单胞菌标准菌株的生理生化特征比较
[0017] 注：" + "表示菌株阳性；表示菌株阴性。
[0018] *:东秀珠、蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版， p364_398〇
[0019] 上述用于菌体形态观察的液体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨 17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2. 5g，葡萄糖2. 5g，并调节pH 7. 5。
[0020] 上述用于菌体形态观察的固体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨 17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2. 5g，葡萄糖2. 5g，琼脂粉15g，并调节pH 7. 5。
[0021] 上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定 手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
[0022] 上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系 统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
[0023] 对本发明所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) YalCGMCC N0. 11426测定 16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1396bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0024] 通过使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的Yal菌株16S rRNA的基因序列与 NCBI注册的多株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) 16S rRNA的基因序列具有高 度同源性（>97% )，个别菌株的相似性甚至更高，可以确定Yal菌株是一株铜绿假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)。选取同源性比较高的典型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的16S rRNA基因序列作为参比对象；采用邻近法（Neighbour-Joining)运用 Mega 5软件构建Yal菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Bacillus licheniformis作 为外群分支，结果见附图3。
[0025] 本发明所述的耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌Yal菌种的选育方法是：
[0026] 将采集到的石油污染的土壤样品用无菌生理盐水溶解，振荡混匀制成土壤悬液， 梯度稀释后涂布到以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基平板上，30°C条件下静置培养， 至有明显的石油降解圈出现，挑取石油降解圈较大的菌落，划线转接到固体培养基上，30°C 条件下静置培养，至有明显的单菌落产生，经两次纯化后，得到耐受微氧和高盐环境的铜绿 假单胞菌菌种，编号Yal，甘油冻藏保菌。该菌株已于2015年9月18日保藏于"中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，其保藏编号为CGMCC N0. 11426。
[0027] 本发明所述耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌在降解石油中的应用或在降解 被石油污染的土壤或水体中的石油的应用。
[0028] 其中：所述耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌在营养培养基上能实现细胞的快 速繁殖和扩增，在含石油培养基上能实现对石油的充分降解；其培养温度为28~37°C，摇 床培养转速为180~220rpm。
[0029] 本发明所述耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌降解被石油污染的土壤或水体 中的石油的微氧条件是氧气浓度为2%~6% ;降解温度优选为30~35°C。
[0030] 本发明所述耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌在降解被石油污染的土壤或水 体中的石油的过程中，其耐受总盐量是0. 5%~5%。
[0031] 本发明所述的耐受微氧和高盐环境的铜绿假单胞菌Yal在2%~6%的微氧条件 下可以正常生长。
[0032] 检测该菌株对微氧耐受性的方法及步骤是：
[0033] (1)菌种选择：选用本发明所述铜绿假单胞菌Yal (CGMCC N0. 11426);
[0034] (2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，28~37°C条件下，静置培养20~ 40小时，备用；
[0035] (3)种子培养：将步骤（2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1~2环于40~ 50mL(25